胚胎干细胞具无限增殖和多向分化潜能，在发育生物学的研究、新基因的发现和功能研究以及组织器官移植重建等领域都具有重要的科学意义、巨大的医学应用价值及经济效益。但是由于胚胎干细胞材料主要是来源于胚胎，因而必须面对损毁生命的伦理学争议和应用于临床治疗时出现的免疫排斥问题。目前一方面是可提供的人类卵子有限，一方面是生殖医学中心存在大量废弃的未成熟卵子。孤雌胚胎干细胞是解决这两个问题的有效途径。本研究旨在建立一小鼠未成熟卵分离孤雌胚胎干细胞系实验模型，为将来构建高效稳定的应用于人未成熟卵分离孤雌干细胞技术平台；并初步探索印迹基因在孤雌胚胎干细胞中的表达和作用。　　 本课题首先是建立了一未成熟卵培养体系，通过氯化锶和细胞松弛素D联合孤雌激活得到高效率的囊胚发育，并进一步摸索了一套适合未成熟卵孤雌干细胞分离培养的方法。分离到具有较强分化潜能的孤雌胚胎干细胞，尤其是其生殖系转移效率远远高于以往有关孤雌干细胞生殖系转移效率的报导。考虑孤雌干细胞来源于未成熟卵，对未成熟卵及其孤雌囊胚和干细胞从印迹基因甲基化和表达上做了进一步的机制探讨。具体研究内容包括以下四部分：　　 通过对小鼠未成熟卵体外成熟和孤雌激活，发现B6C3F1未成熟卵培养成熟后孤雌激活囊胚率为86％，低于对照组体内成熟卵孤雌激活囊胚率100％； B6129Fl未成熟卵培养成熟后孤雌激活囊胚率为65％，低于对照组体内成熟卵孤雌激活囊胚率98％。　　 小鼠未成熟卵孤雌囊胚移植在MEF上后，原代生长培养和传代：改良培养体系，用含KSR的干细胞培养液代替FBS干细胞培养液在B6C3F1品系中成功地分离到17株未成熟卵孤雌干细胞，其中用含FBS的培养液分离了11株，效率为11％；KSR的培养液分离了6株，其效率为42.9％。在B6129F1品系中，用KSR的培养液分离到7株，其分离效率为21.2％。用KSR的培养液分离效率高于FBS的培养液分离效率。　　 对未成熟卵孤雌激活分离的干细胞进行多能性的相关鉴定。小鼠未成熟卵孤雌干细胞系1116核型正常，具有干细胞系有关的生物学特征，体外拟胚体实验和体内畸胎瘤实验都证明其能向胚胎发育的三个胚层分化。另外1116pES(B6C3F1品系)和11191pES(B6129F1品系)嵌合体生殖系转移实验证明未成熟卵孤雌干细胞是具有较高的生殖系转移效率，接近于正常受精干细胞系的生殖系转移效率。　　 小鼠未成熟卵孤雌干细胞印迹基因和甲基化状态方面的研究发现：1、体外未成熟卵Impact基因的mRNA表达的量高于体内成熟卵的表达量；2、未成熟卵来源孤雌囊胚H19表达量低于成熟卵孤雌囊胚，但二者都高于正常受精囊胚，孤雌囊胚Snrpn和Slc38a4不表达或表达偏低；3、未成熟卵来源的孤雌胚胎干细胞IVM1116pES和成熟卵来源干细胞C3pES中H19表达量都高于正常受精胚胎干细胞BF10，但IVM1116pES中H19表达量更趋于接近BF10表达量；4、H19基因DMR区从卵子到孤雌囊胚、孤雌生殖干细胞基本为未甲基化状态，而Snrpn在卵子完全甲基化到孤雌囊胚少量去甲基化；1116pES甲基化程度接近于正常受精干细胞BF10甲基化程度。　　 总之，成功分离和建立了小鼠未成熟卵孤雌干细胞系；发现含血清替代物的干细胞培养液分离比含胎牛血清的培养液，分离胚胎干细胞效率更高；由未成熟卵分离的孤雌干细胞具有较强的分化潜能，尤其是生殖系转移效率高于以往孤雌胚胎干细胞的研究报告；印迹基因在卵子囊胚和干细胞中表达和甲基化分析H19和IGF2可能是影响孤雌胚胎干细胞多能性的重要因素。