论文部分内容阅读
研究目的：以腮腺炎减毒活疫苗病毒作为溶瘤病毒,研究其对肿瘤的抑制效果,分析其抗肿瘤的作用机制,为肿瘤治疗探索新思路。研究方法：本文采用腮腺炎减毒活疫苗病毒(杭州市疾病控制中心)、小鼠胃癌细胞系(MFC)和人肾母细胞瘤细胞系(G401)开展研究。实验主要分为3组,分别是腮腺炎减毒活疫苗病毒原液组、腮腺炎病毒原液*10-1组(即病毒滴度为原液组的1/10)和无病毒的对照组。1.采用Vero细胞体外扩增病毒,收集腮腺炎减毒活疫苗病毒；利用空斑形成单位PFU法,测定病毒滴度。2.96孔细胞培养板内接种细胞,采用CCK-8检测腮腺炎减毒活疫苗病毒原液组对MFC、G401肿瘤细胞的抑制作用。3.通过FITC Annexin V/PI-流式细胞方法,在腮腺炎减毒活疫苗病毒诱导下,连续3天观察MFC、G401肿瘤细胞的凋亡率变化。4.获取腮腺炎减毒活疫苗病毒感染3天后的MFC、G401肿瘤细胞,提取DNA全基因,进行DNA电泳,明确DNA Ladder凋亡小体的形成。5.提取腮腺炎病毒感染3天后的MFC、G401肿瘤细胞蛋白,进行Western Blot蛋白电泳,检测自噬相关蛋白P62、LC3(LC3-Ⅰ,LC3-Ⅱ)变化趋势。6.初步开展在体实验,向小鼠前肢腋下注射MFC小鼠胃癌肿瘤细胞,建立小鼠胃癌荷瘤动物模型。实体肿瘤形成后,分组注射高剂量、低剂量腮腺炎病毒和PBS对照量,观察腮腺炎病毒对小鼠实体肿瘤增长的抑制作用。研究结果：1.以Vero细胞作为腮腺炎减毒活疫苗病毒生长的宿主,成功提取大批腮腺炎减毒活疫苗病毒。采用空斑形成单位PFU方法,明确了提取的腮腺炎病毒滴度,纯化后可进一步提高滴度。2.腮腺炎减毒活疫苗病毒较之于麻疹、水痘等疫苗病毒,对MFC小鼠胃癌细胞和G401人肾母细胞瘤有更强的抑制率,分别达到58.31%和49.52%,说明腮腺炎病毒对这两种肿瘤细胞均有杀伤作用。3. MFC、G401两类肿瘤细胞感染腮腺炎减毒活疫苗病毒后,随时间推移,其形态学发生明显改变,表现为细胞稀疏,间隙增大,细胞狭长,细胞内有黄褐色颗粒堆积,细胞核消失呈碎片状,细胞膜溶解,可见残渣,最终死亡。4.腮腺炎减毒活疫苗病毒诱导下的MFC细胞凋亡增加。连续3天腮腺炎减毒活疫苗病毒原液组、*10-1组和对照组的流式细胞分析,凋亡率分别为3.98%、3.44%和2.16%(24h)；21.2%、2.72%和2.39%(48h);51.0%、4.63%和2.12%(72h)。另外,MFC感染腮腺炎病毒后出现]DNA Ladder,也提示MFC细胞出现凋亡。说明腮腺炎病毒对MFC的杀伤作用主要是通过细胞凋亡程序进行的。5.腮腺炎减毒活疫苗病毒诱导下的G401细胞自噬增加。Western Blot蛋白电泳提示P62下降,LC3和LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ升高,表明G401肿瘤细胞在腮腺炎病毒诱导下发生自噬。说明腮腺炎病毒对G401的杀伤作用主要是通过细胞自噬程序进行的。6.基本建成肿瘤小鼠模型,成瘤率达85.71%。初步实验发现腮腺炎减毒活疫苗病毒能够抑制荷瘤小鼠体积增加。结论：1.腮腺炎减毒活疫苗病毒在体外可以有效抑制肿瘤细胞(MFC、G401)的增殖,促进肿瘤细胞变形、稀疏,直至死亡。2.腮腺炎减毒活疫苗病毒促进不同肿瘤细胞死亡的机制不同。小鼠胃癌细胞MFC主要通过激活凋亡程序,而人肾母细胞瘤G401主要是启动自噬程序。3.腮腺炎减毒活疫苗病毒可抑制荷瘤小鼠肿瘤生长。因此,腮腺炎减毒活疫苗病毒作为溶瘤病毒,可为肿瘤治疗提供新思路。