子宫内膜异位症（endometriosis,EMS）是子宫内膜腺体和间质种植于子宫以外的雌激素依赖性疾病。其异位灶的生长除依赖于卵巢产生的雌激素外,还依赖于异位灶自分泌的雌激素。研究表明,异位内膜组织高表达细胞色素芳香化酶P450（P450arom）,而P450arom是雄激素转化为雌激素的限速酶和关键酶,目前临床上使用芳香化酶抑制剂治疗EMS取得了较满意的治疗效果。但是这些药物均具有肝功能损害、低雌激素状态所致更年期样改变等副作用,不能长期服用。且服药期间异位灶组织仍存在,一旦停药,异位灶容易死灰复燃。植物雌激素作为弱活性的雌激素分子占据了受体的结合部位,对生殖期妇女起到抗雌激素活性作用。同时最新研究表明植物雌激素（phytoestrogens）还可以抑制P450arom的表达。葛根素（puerarin）是从中药葛根中提取的异黄酮类植物雌激素,根据植物雌激素的作用特点和EMS病理特征我们认为葛根素很可能是治疗EMS潜在的药物。前期研究显示葛根素能明显抑制EMS大鼠异位灶的生长,抑制异位灶组织及内膜细胞P450arom的表达,本实验主要研究葛根素影响子宫内膜异位症芳香化酶基因表达的调控路径,为其临床应用提供理论依据。研究目的1、通过观察葛根素对雌激素反应元件（ERE）荧光素酶报告基因质粒的转录调节作用,明确葛根素与雌激素受体亚型ERα、ERβ的亲和力。2、在雌激素受体拮抗剂ICI182780作用下,进一步观察葛根素对ERE荧光素酶报告基因质粒的转录激活是否依赖雌激素受体途径。3、在有无ICI182780作用下,观察葛根素对子宫内膜癌细胞（RL95-2）P450arom表达的影响,明确葛根素是否通过雌激素受体途径（estrogen receptor,ER）抑制芳香化酶P450的表达。研究方法1、分别将ERα/β表达质粒与雌激素反应元件ERE的荧光素酶报告基因（2ERE-39PRL-Luc）质粒共转染到ER表达缺失的宫颈癌细胞（HeLa）中,转染12h后,加入梯度稀释的葛根素与雌激素作用刺激,利用双荧光素酶检测系统检测荧光素酶活性。探讨不同浓度下葛根素与ERα/β的亲和力。2、将ERα/β表达质粒与雌激素反应元件ERE的荧光素酶报告基因（2ERE-39PRL-Luc）质粒共转染到ER表达缺失的HeLa细胞中,转染12h后加入ICI182780(10^-5mol/L)和葛根素(10^-4mol/L)共同作用HeLa细胞,利用双荧光素酶检测系统检测其荧光素酶活性。研究ICI182780对葛根素转录激活机制的影响。3、在RL95-2细胞中加入雌激素受体拮抗剂ICI182780(10^-5mol/L)作用0.5h后,进一步加入葛根素(10^-7mol/L),分别使用Real-time PCR以及Western blotting实验方法检测葛根素对RL95-2细胞P450arom的mRNA水平和蛋白水平的影响。分析葛根素是否通过ER途径抑制芳香化酶P450的表达。研究结果1、将ERE荧光素酶报告基因质粒单独转染HeLa细胞后,葛根素和雌激素对ERE荧光素酶报告基因质粒的转录激活无明显影响。当将ERα或ERβ与ERE荧光素酶报告基因质粒共转染HeLa细胞后,(10^-4mol/L-10^-9 mol/L)葛根素和(10^-4mol/L-10^-9 mol/L)雌激素均可诱导ERE荧光素酶报告基因质粒的转录激活。而低浓度(10^-9mol/L)葛根素只能通过ERβ途径激活ERE荧光素酶报告基因质粒的转录,对过表达ERα的HeLa细胞则没有明显作用,提示葛根素与ERB亲和力更高。2、在ERα或ERβ过表达的HeLa细胞中,ICI182780(10^-5mol/L)能够完全阻断葛根素(10^-4 mol/L)和雌激素(10^-5 mol/L)对过表达ERα的HeLa细胞中ERE荧光素酶报告基因质粒的转录激活作用;而在过表达ERβ的HeLa细胞中,ICI182780同样能完全阻断雌激素的转录激活作用,能部分阻断葛根素的转录激活作用。3、在加入葛根素(10^-7mol/L)或雌激素(10^-5mol/L)的RL95-2细胞中,雌激素受体拮抗剂ICI182780(10^-5mol/L)能够明显影响RL95-2细胞P450arom的mRNA水平和蛋白水平,实验结果表明葛根素是通过ER途径抑制芳香化酶P450的表达。结论1、低浓度的葛根素只能通过ERβ激活ERE荧光素酶报告基因的转录,提示葛根素与ERβ亲和力更高。2、ICI182780能完全阻断雌激素和部分葛根素对ERE的转录激活作用,表明葛根素与雌激素一样其转录激活作用是依赖于ER存在的。3、ICI182780能够减弱低浓度葛根素对RL95-2细胞内P450arom mRNA水平和蛋白水平的抑制作用,表明葛根素是通过ER途径抑制芳香化酶P450的表达。