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淀粉样前体蛋白APP是AD的一个关键蛋白,实验室已有研究基础表明APP与hsp70、hsp90、Bip以及NCAM之间均存在着相互作用。基于上述研究结果,为了对APP的生理以及病理功能进行研究,我们在本文中选择了分子伴侣hsp70、hsp90、Bip对APP水解代谢的影响以及NCAM与APP相互作用两方面内容作为我们的研究对象。 为了研究分子伴侣对APP水解代谢的影响,我们采用了两种方式来研究APP的水解代谢,一是在稳定转染细胞株中过表达分子伴侣:hsp70、Bip、hsp90,检测其对APP蛋白表达量和Aβ40分泌量的影响;二是利用双荧光素酶报告基因检测系统检测过表达分子伴侣hsp70、Bip对APP的被切割水平的影响。具体方法如下:利用真核表达载体pcDNA3.1-myc-his,构建β淀粉样前体蛋白APP695全长cDNA重组质粒。将上述重组质粒转染CHO细胞,建立APP695/CHO稳定转染细胞株。在稳定转染细胞株中分别过表达分子伴侣hsp70、Bip、hsp90,21h后收集细胞培养上清和细胞中蛋白。ELISA检测试剂盒鉴定培养上清中Aβ40水平,Western blotting鉴定细胞中APP的表达水平。双荧光素酶报告基因检测系统方法如下:我们将萤火虫荧光素酶表达基因激活元件GV与APP695融合表达,当APP695被切割,GV就会从APP上脱落下来进入核中,激活荧光素酶的表达,过表达分子伴侣后收集细胞裂解液检测两种荧光素酶表达水平即APP被切割水平。结果显示过表达分子伴侣hsp70、Bip、hsp90不会影响稳定转染细胞系中APP695表达水平和Aβ40分泌水平,过表达分子伴侣hsp70、Bip也不会影响APP695的被切割水平。 为了对APP的正常生理功能进行研究,我们选择了NCAM这个在神经系统中具有重要作用的分子作为我们的研究对象。首先在C57小鼠中用免疫共沉淀确认了APP与NCAM140的相互作用关系。其次用构建突变体免疫共沉淀的方式找出了两者相互作用结构域分别为NCAM的两个FN3结构和APP的E2结构。最后,我们希望通过GST-pulldown寻找出模拟或抑制相互作用的mimetics肽段,目前这部分工作正在进行中。