目前,全球大约有3亿5千万人感染乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV),约5%左右最终发展为肝炎后肝硬化,每年因HBV感染而死亡的人数近1百万。而我国HBV感染人群比例则更多,据不完全统计在10%～20%之间。目前治疗乙型肝炎相关性终末期肝病最有效的方法仍是原位肝移植(orthotopic liver transplantation , OLT)。然而,如果不采取一定的预防措施,移植后乙型肝炎的复发率高达80%以上,可导致移植肝功能衰竭,或需再次肝移植甚至受体死亡。HBV的再感染已成为乙型肝炎相关性肝病OLT后移植肝功能丧失(liver dysfunction)的主要原因,如何防治肝移植后乙型肝炎复发,已成为目前急待解决的问题。尽管乙型肝炎免疫球蛋白(HBIg)及核苷类似物如拉米夫定(lamuvidine, LMV)等抗病毒制剂的推广应用,而且新的抗病毒药物还在不断出现,但相应的HBV耐药性突变株仍不断有报道,再感染仍未得到有效控制,并直接影响到移植肝的长期存活。研究发现,HBIg耐药性突变株主要与病毒S基因区有关, LMV则主要导致HBV多聚酶(P)区YMDD基序变异。P区被认为是核苷类似物类药的作用靶位,但S基因区与其完全重叠,P区突变亦会反映在S基因变异上。准种(quasispecies)是由Eigen首先提出的用于描述同种生物遗传异质性的概念。在病毒学研究领域,准种被用于表示感染个体内同种病毒的遗传异质性(heterogeneity)。同人类免疫缺陷病毒(HIV),HBV复制逆转录过程的易错配(error-prone)及多种可能的选择性压力作用如免疫制剂与抗病毒药物等使感染个体内的HBV种群具有明显的准种特性及基因异质性。HBV准种特性在慢性乙型肝炎患者中已得到证实。而迄今,尚无有关肝移植前后HBV准种演变报道。基于上述背景,我们以OLT后HBV再感染者为研究对象。首先,筛选我国近年来LMV应用于OLT后HBV再感染的发生概貌、相关易感因素及新一代核苷类似物阿德弗韦(adefovir,ADV)用于LMV耐药性病例的抗病毒疗效。其次,采用高保真的DNA聚合酶及结合SSCP/HD分析的核酸长度要求,PCR扩增7例再感染HBV基因组逆转<WP=12>录酶(RT)B～D区460bp产物;TA克隆后,以SSCP/HD分析筛选准种的克隆型,并进行优劣势克隆型核酸序列分析。通过核酸与氨基酸序列对照分析,了解肝移植前后HBV聚合酶区准种的的分布、组成及其演化。最后,针对两例ADV治疗无效的患者,对服药前后与核苷类似物类药耐药有关的HBV基因组整个逆转录酶(RT) A～E区域进行PCR扩增,随机10个克隆测定DNA序列,力求及时了解有无可疑的耐药性变异株出现。本研究旨在明确肝移植前后HBV再感染者体内病毒代表性准种的组成及演变,为肝移植后乙型肝炎复发的发病机理,抗病毒治疗,以及针对各种逃逸株的疫苗研制等提供一定的理论依据。主要研究结果如下:1. 本组肝移植患者中83.3%(85/102)为HBV感染的相关性肝病,提示此类患者是本地区肝移植的主要对象;虽然大多采取了预防性治疗措施,而肝移植后HBV再感染仍较为严重,占随访期间病例的27.0%(17/63);随着肝移植时间延长,再感染率亦上升。术前血清HBV DNA阳性及有LMV耐药性病毒株者更易发生术后再感染(P<0.05)。ADV对多数LMV耐药性病例的治疗有效,但有少数患者无效。术后各时间段HBV再感染率分别是:半年内9.5%,半年～1年 13.2%,1～2年 27.8%,2～3年 41.2%,3年以上 60.0%。多因素统计分析显示,术前血清HBV DNA阳性与服用LMV时间均与HBV再感染呈正相关(P<0.05)。8例服用ADV患者均在服药1个月后血清HBV DNA载量均出现不同程度的下降,除1病例J服药时间还不足2个月外,其余7例有5例在服药2个月后HBV DNA降至0 copy/ml。其中有2例出现对ADV抗病毒治疗无效。1例出现HBsAg/抗-HBs的血清学转换。2. SSCP/HD分析结合核酸序列分析可迅速、准确地分析准种复杂性及基因差异性(diversity)。肝移植前HBV P区准种有10～13种克隆型,HBV再感染后其克隆型有不同程度的下降,为4～8种克隆型,统计分析准种复杂性有显著差异性(t=6.379,P<0.01)。进一步的序列分析同样显示了准种序列的差异性改变及病毒种群的漂变(shift)。证实了肝移植前后其病毒多聚酶区有明显的准种演变发生。3. 核酸序列分析在半数病例中发现了少数可能是共有的HBV RT区氨基酸序列变异组合及不明功能的变异体,个别位点出现了回复性突变。P基因区突变亦伴有S区氨基酸序列变异。术前已接受LMV治疗半年以上的患者均有耐药病毒株存在。虽然采取了LMV防治措施,但接受抗-HBe及抗-HBc阳性的供体肝仍是不安全的。优劣势克隆型P区序列分析发现,6例中有2例(33.3%)出现ntG531→A,相应的氨基酸替换为rtD134N;以及ntA669→T、rtM180L的回复性突变。其他均为单个病<WP=13>例的改变,如ntA495→T、rtF122I,ntA532→T、rtT135S,ntG741→A、rtV204I/M。而另外两例的突变ntT638→A并未导致氨基酸基序的变化,属无意突变。术前服用LMV 1～2年左右的病例E、K、N、P在术前即存在不同的耐LMV突变组合。而分析S区序列显示多个序列存在sM213I。病例P接受了血清抗-HBe及抗-HBc阳性的供体肝,经准种筛选及克隆型序列分析发现,手术前后核酸序列间同源性相差甚远,最高在8%以上,考虑其手术前后为不同基因型的病毒株感染,术后感染病毒可能来源于供体肝。4. ADV对多数LMV耐药的