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破骨细胞(osteoclast,OC)是一种由巨噬细胞集落刺激因子(macrophage colony stimulating factor,M-CSF)和核因子κB 受体活化因子配体(receptor activator for nuclear factor-KBIigand,RANKL)等细胞因子诱导形成的多核巨噬细胞,具有骨吸收活性。维生素D是一种类固醇激素,在调节体内钙磷代谢和维持骨稳态中有重要作用。1α,25-(OH)2D3是维生素D3的重要活性形式,参与了对OC形成的调控。半乳糖凝集素3(galectin-3,gal-3)在机体内分布广泛,功能多样,也可调控OC形成。本研究以25 ng mL-1 M-CSF和50 ng.mL-1 RANKL体外诱导培养C57BL/6小鼠骨髓单核细胞分化形成OC为基础,研究1α,25-(OH)2D3对OC形成和骨吸收功能以及β-catenin和gal-3等信号通路的影响,并通过激活或干扰β-catenin或gal-3,明确其在1α,25-(OH)2D3调控OC形成和骨吸收功能中的作用,为1α,25-(OH)2D3调控钙磷代谢的机制研究提供理论依据。1.1α,25-(OH)2D3对OC形成和骨吸收功能的影响为揭示1α,25-(OH)2D3对体外培养小鼠OC形成和骨吸收功能的影响,本研究通过RTCA、CCK-8检测细胞增殖、抗酒石酸酸性磷酸酶染色检测OC数量、Westerm blot检测OC骨吸收功能相关蛋白和转录因子蛋白表达水平、免疫荧光和扫描电镜观察OC骨架和形态、骨细胞培养板分析骨吸收陷窝面积等,发现10nM 1α,25-(OH)2D3对细胞增殖无显著影响,但能显著抑制OC形成,抑制骨吸收功能相关蛋白和转录因子蛋白的表达,阻碍OC骨架肌动蛋白环和伪足小体的形成,减弱OC骨吸收功能。表明,1α,25-(OH)2D3能抑制体外培养小鼠OC的分化和骨吸收活性。2.1α,25-(OH)2D3对OC形成中gal-3、β-catenin和相关信号通路的影响为探究1α,25-(OH)2D3对体外培养小鼠OC形成相关信号和gal-3、β-catenin的影响,利用Westerm blot、免疫荧光检测分化相关蛋白,qRT-PCR检测相关基因表达。结果表明,1α,25-(OH)2D3 对 RANKL 诱导的 MAPKs、Akt、GSK-3β和 CREB 蛋白变化无影响。1α,25-(OH)2D3对c-fms、RANK的蛋白表达也无影响。OC分化过程中,gal-3蛋白和mRNA表达升高,β-catenin蛋白和mRNA表达下降,1α,25-(OH)2D3可激活OC形成中gal-3、β-catenin 蛋白和 mRNA 的表达,10nM 1α,25-(OH)2D3 效果最显著。表明,1α,25-(OH)2D3 能调控体外培养小鼠OC形成过程中gal-3和β-catenin的表达。3.β-catenin在1α,25-(OH)2D3抑制OC分化中的作用为探究β-catenin在1α,25-(OH)2D3调控OC分化中的作用,激活或敲减β-catenin后,使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色、Western blot、qRT-PCR和骨吸收陷窝等检测方法,观察OC数量、标志蛋白及骨吸收活性。结果表明,Bio激活β-catenin可抑制OC形成数量、分化相关蛋白和基因的表达。通过siRNA敲减OC前体细胞的β-catenin,发现β-catenin敲减可促进OC形成,但对1α,25-(OH)2D3抑制OC分化无显著影响。表明β-catenin敲减不影响1α,25-(OH)2D3对OC分化的抑制作用。4.gal-3在1α,25-(OH)2D3抑制OC分化中的作用为探究gal-3在1α,25-(OH)2D3抑制体外培养小鼠OC分化中的作用,采用siRNA敲减OC前体细胞中的gal-3,使用抗酒石酸酸性磷酸酶染色、Western blot、qRT-PCR、骨吸收陷窝、免疫沉淀和免疫荧光双染等检测方法,检测OC数量、相关蛋白和基因及OC骨吸收活性,gal-3和VDR的关系。结果表明,gal-3敲减可促进OC形成,减弱1α,25-(OH)2D3对OC分化的抑制作用。Gal-3和VDR存在互相作用。表明gal-3在1α,25-(OH)2D3抑制OC的分化中起一定作用。综上所述,1α,25-(OH)2D3可抑制小鼠体外OC分化和骨吸收活性,并且上调β-catenin和gal-3的表达,β-catenin敲减不影响1α,25-(OH)2D3对OC分化的抑制作用,gal-3敲减可促进OC形成,抑制1α,25-(OH)2D3对OC分化的调控。