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目的:研究α-突触核蛋白(α-Synuclein,α-Syn)在正常大鼠脑线粒体中的表达及其在不同脑区和不同年龄大鼠脑线粒体中表达量的变化;研究线粒体中的α-Syn对线粒体功能的影响,为进一步探讨帕金森病中α-Syn的表达异常和线粒体功能缺陷之间的相互关系提供理论依据。
方法:
1.提取成年Wistar系大鼠不同脑区神经细胞的线粒体和胞浆蛋白,用免疫印迹方法进行半定量分析α-Syn的含量。提取出生后不同年龄大鼠海马区的线粒体和胞浆,分析α-Syn表达量的变化。
2.将人重组α-Syn与分离的不含内源性α-Syn的小脑和心肌线粒体孵育,用免疫印迹方法检测α-Syn是否可以转运到线粒体中;用洋地黄皂苷消化线粒体外膜以排除α-Syn非特异性黏附于线粒体外膜。
3.将不同浓度人重组α-Syn与分离的心肌线粒体进行孵育,测定呼吸链复合体I的活性。
结果:
1.α-Syn存在于正常大鼠脑的线粒体中,其分子量与胞浆α-Syn的分子量相同,均为18kD。不同脑区的线粒体中α-Syn含量不同,其中纹状体、嗅球、海马和丘脑的线粒体中α-Syn含量较高,大脑皮质和脑干的线粒体中α-Syn含量较低,在小脑的线粒体中几乎未能检测到α-Syn。除了大脑皮质和小脑外,不同脑区线粒体中α-Syn的含量与该脑区神经细胞胞浆中α-Syn的含量基本一致。在大脑皮质和小脑,尽管胞浆中的α-Syn含量较高,但线粒体中α-Syn的含量却很低。对海马脑区α-Syn表达量的分析表明,该部位线粒体中的α-Syn在生长发育过程中持续增长,而后保持在一个较高水平。
2.人重组α-Syn与分离线粒体进行孵育后,以一种剂量依赖的方式转运到线粒体内;α-Syn向线粒体的转移速度很快,孵育5分钟后即可在线粒体内检测到α-Syn的存在,延长孵育时间未见线粒体中的α-Syn呈现时间依赖性的增加。将线粒体的外膜用洋地黄皂苷破坏后仍可检测到α-Syn说明所检测到的α-Syn可以转移到线粒体内膜中,而非黏附外膜上。
3.将不同浓度(1pM、102pM、104pM)的人重组α-Syn与线粒体孵育后,线粒体复合体I活性下降,并且呈明显的量-效关系,提示α-Syn能够抑制线粒体复合体I的活性。
结论:在正常情况下,α-Syn存在于大鼠脑线粒体中,并且在不同脑区的表达量不同。除大脑皮质和小脑外,不同脑区线粒体和胞浆中α-Syn的表达量基本一致。线粒体中的α-Syn在生长发育过程中持续增长,而后保持在一个较高水平。线粒体的α-Syn有可能来源于胞浆α-Syn向线粒体的转运,并且抑制复合体I的活性。