【摘 要】
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外泌体（exosome）是由细胞分泌的大小在80-150nm的小囊泡。各类正常细胞及肿瘤细胞在不同生理条件下均可释放外泌体。健康人与乳腺癌病人的循环外泌体miRNA表达存在差异,可作为诊断并预测乳腺癌疗效的分子标志物。在临床上,逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）是检测和分析定量miRNA的一种精确方法。然而,迄今为止针对乳腺癌血清外泌体miRNA的RT-qPCR研究中内参基因的选择尚无标准;
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外泌体（exosome）是由细胞分泌的大小在80-150nm的小囊泡。各类正常细胞及肿瘤细胞在不同生理条件下均可释放外泌体。健康人与乳腺癌病人的循环外泌体miRNA表达存在差异,可作为诊断并预测乳腺癌疗效的分子标志物。在临床上,逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）是检测和分析定量miRNA的一种精确方法。然而,迄今为止针对乳腺癌血清外泌体miRNA的RT-qPCR研究中内参基因的选择尚无标准;临床上由于外泌体提取方式差异、血清样本起始量差异、样本是否溶血等因素对乳腺癌血清外泌体RNA检测的影响尚不得知;已有研究指出miR-940的表达水平在乳腺癌组织中较正常组织低,但血清外泌体中miR-940的水平与乳腺癌之间的关系还未明确。因此,本研究通过五种算法筛选出适用于标准化血清外泌体miRNA的参考基因;随后利用血清外泌体miR-940验证了筛选出的基因可靠性,并比较了三种外泌体提取方式对外泌体miRNA水平的影响,以及不同的血清初始量、不同血清状态下血清外泌体miRNA的表达水平,筛选了适用于临床检测血清外泌体miR-940的样品前处理方法;最后分析了血清外泌体miR-940与病人病理特征,证明了其作为转移标志物的潜力。通过上述研究,初步建立了检测血清外泌体miR-940的优化方案。本论文主要研究内容如下:1、筛选出适用于标准化乳腺癌血清外泌体miRNA的内参基因。首先通过RT-qPCR验证了候选基因的表达水平在乳腺癌病人和正常人血清外泌体中无显著差异;通过Ge Norm、Norm Finder、Best Keeper和△CT四种算法分析候选基因作为内参的适用性,四种算法由于算法的差异得出了不完全一致的结论:Ge Norm得出miR-1228和miR-191是最合适的内参组合;Norm Finder得出miR-191是最合适的内参基因;Best Keeper得出miR-423是最合适的内参基因;ΔCt法得出miR-1228是最合适的内参基因。最后通过Ref Finder综合四种算法的结果,得出miR-1228和miR-191是适用于乳腺癌血清外泌体miRNA标准化的内参基因。2、筛选适用于临床检测血清外泌体miR-940的样品前处理方法。首先,使用候选内参对miR-940的表达稳定性进行验证。结果显示选用miR-191和miR-1228作为内参时,miR-940的表达水平在乳腺癌和健康人群中存在显著差异;而选用其他候选基因时,血清外泌体miR-940的表达水平在乳腺癌和健康人群中无显著差异。相同样本起始体积前提下使用超速离心法提取外泌体后其RNA含量较低,证明超速离心法不适用于临床上外泌体RNA检测;而膜亲和法和沉淀法提取出外泌体其RNA水平没有显著差异;当血清体积每增加一倍,血清外泌体miRNA的Ct值递减三个循环;在溶血的血液中,提取出的外泌体miR-16、miR-940、miR-1228的表达水平显著高于未溶血血液的外泌体RNA水平。因此得出结论:临床上检测乳腺癌外泌体miRNA的表达水平,应使用适量体积的未溶血的血液标本并使用膜亲和法进行血清外泌体RNA提取。3、研究了血清外泌体miR-940在乳腺癌中的表达意义。通过建立的miR-940拷贝数标准曲线,计算出每个样本中外泌体miR-940的拷贝数,发现乳腺癌病人的血清外泌体miR-940拷贝数显著低于正常人的血清外泌体miR-940拷贝数;血清外泌体miR-940拷贝数在HER2/neu阳性病人中显著低于HER2/neu阴性病人;无淋巴结转移的乳腺癌病人血清外泌体miR-940拷贝数显著高于有淋巴结转的病人。体外细胞实验证明miR-940能够通过外泌体转运到乳腺癌细胞和乳腺上皮细胞中,上调靶细胞内miR-940的水平并抑制靶细胞的增殖和迁移。上述结果提示外泌体miR-940可作为乳腺癌患者转移的标志物。
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