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人参属主要分布于北美东部海岸、喜马拉雅及以东地区,包括三个珍贵药用植物Panax ginseng C.A.Meyer,P quinquefolius Linn.和P.notoginseng(Burkill)F.H.Chen ex C.Y.Wu et K M.Feng,并且全属大多数物种均可入药,具有重要的药用价值,因而该属倍受关注.北美的P.trifolius Linn.经历了洲际间断分化事件,成为人参属的基部原始类型,与其他物种分化显著.P.stipuleanatus C.T。Tsai et K.M.Feng和P.pseudoginseng Wallich是东亚人参属最为原始的物种.以P.bipinnatifidus Seem.为代表的支系则具有相对较短的进化历史,在物种形成中表现出辐射进化的快速分化特征.这一支同时包括了二倍体和多倍体,形态上具有居群差异性,形成了众多的并行谱系,分布在中国的横断山-喜马拉雅地区,因而这一地区也成为该属的多样性中心和分化中心.因此,对辐射进化事件的深入研究成为澄清该属系统发育关系的关键所在,也是研究人参属物种形成、种群扩张、地理替代等事件的核心内容。
1.辐射进化类群的居群遗传学特点
选取处于人参属现代分化中心的12个居群共123个个体,采用从40对ISSR引物中筛选出的13对最佳引物进行扩增片段长度差异检测;从64对AFLP引物组合中选择4对对所有样品进行分析,结合ISSR数据进行居群的遗传学特点分析.人参属植物的居群间存在较大遗传分化(Gst=0.536,0.602),且居群之间基因流较小(Nm=0.3302,0.4328),可能因此发生了遗传漂变导致群体发生明显分化.居群间遗传差异相对较大(53.02%),居群内遗传差异略小(62.39%).因此,人参属存在较强的居群地理分化,在系统发育树上表现为来自相同居群的样品聚为一支.然而,居群之间的遗传分化并没有表现在根据形态定义的物种水平上.这些形态学种多表现为缺乏分辨率而形成的并系结构,也说明了居群的辐射进化历史.相对而言,喜马拉雅地区人参属植物遗传成分复杂,可能与其较长的进化历史相关.西藏的部分群体表现出了与进化上相对原始的P.stipuleanatus更近的亲缘关系;处于秦巴山区的群体表现出独立分化的特征.喜马拉雅地区的尼泊尔居群间存在微弱的基因流,具有遗传分化历史较短的特征。
2.群体分化和物种形成
在扩大了人参属的取样范围并加大取样密度的基础上,分析人参属的物种形成机制.样品来自人参属所有物种共46个群体358份样品,覆盖了整个分布区.从叶绿体基因中筛选出进化速率和遗传变异适中的3个叶绿体基因片段和核糖体ITS片段进行序列分析.人参属的居群具有较强的地理结构(Nst>Gst),基因流很小,居群间遗传分化显著.其叶绿体单倍型分布呈现出横断山脉和秦巴山区两个分化中心的模式,而核糖体ITS单倍型则显示缺少共有祖先单倍型,居群分化强烈.从地理分布上看,人参属呈现出从北到南扩散,从西向东扩散的趋势.并且在不同海拔高度,具有遗传变异的垂直分布特征.物种分化与地理格局形成的时间,经化石标定后根据分子钟估算得出P.quinquefolius与东亚姊妹群的分化时间发生在9.4 mya,白令陆桥尚未断开的时候,因此该物种可能经由东北进入俄罗斯,再穿越白令陆桥进入北美.由于落基山脉的限制,该物种存留于美洲东部海岸.P.bipinnatifidus分支的辐射进化发生在11.4 mya以来,与喜马拉雅地区的剧烈隆升在时间上相吻合。
3.微卫星引物的开发
为了深入分析人参属的遗传分化特点,我们通过构建富集的微卫星文库,分离了药用植物三七(P.notoginseng)和羽叶三七(P.bipinnatifidus)的微卫星位点。羽叶三七获得的328阳性克隆中,选取分子量不同的97个(30%)进行插入片段测定,其中18(18.6%)个片段含有15个特异的微卫星位点.根据DNA序列,设计得到10对引物用于微卫星位点的扩增.10对引物的长度在19bp至21bp间,GC含量在36.4%至57.1%间.三七的228个阳性克隆,测定了其中132(58%)个含有插入片段克隆的序列,有52(39%)条序列含有不同的微卫星位点,分离出微卫星位点19个,设计得到16对引物.选取P.bipinnatifidus检测微卫星引物在种间扩增,7对引物成功的扩增出了条带,其中有4对显示多态性,3对为单态性。
4.寡拷贝核基因SQS和LEAFY的开发
应用单拷贝或寡拷贝高变异性核基因是解决人参属进化生物学问题的关键。为此,基于人参属几个物种SQS基因的mRNA序列保守区,通过设计引物进行扩增,以获得SQS基因的DNA序列.选取有代表性的P.stipuleanatus,P.quinquefolius和P.bipinnatifidus进行分析,获得了该基因4270bp的区段.系统发育关系分析表明,SQS基因在人参属中存在多个拷贝.我们尝试了在其它类群基本上为单拷贝的LEAFY基因第二个内含子的调取.这个内含子在五加科为多拷贝,其中的一个拷贝具有较好的分辨率,可望应用到人参属的研究中。
5.人参属的条形码鉴定
人参属的8个物种(含P.bipinnatifidus复合种)应用被国际DNA条形码联盟植物工作组推荐的候选位点和在人参属系统发育分析中应用较好的位点进行检测,以评估各个标记的变异性及其在人参属中的分辨能力.其中,ITS序列的变异位点最多,psbM-trnD与psbK-psbI的组合在物种水平的鉴定能力最强(分辨率100%),而ITS与psbA-trnH在P.bipinnatifidus复合种内部的分辨能力最强(100%)。