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目的:采用紫杉醇化疗富集喉癌干细胞并鉴定喉癌干细胞;研究本课题组前期已成功构建的纳米药物复合物（mPEG-CS-cRGD/Bmi-1RNAi-PTX）对喉癌干细胞的抑制效果,结合细胞实验与生物信息学分析来研究并推测该纳米药物复合物在喉癌治疗方面的作用机制,为喉癌的基因靶向治疗研究向临床应用的转化提供依据。方法:1.培养人的喉癌Hep-2细胞株,用化疗药物紫杉醇对喉癌Hep-2细胞进行富集后取得喉癌肿瘤干细胞（CSC）;分别用流式细胞术、平板克隆实验、球形成实验,qPCR和WB鉴定富集所得的细胞的喉癌干细胞比例、克隆形成率（CFE）、细胞球形成效率（SFE）,干性基因相对表达量;2.探讨该纳米药物复合物杀伤喉癌干细胞的具体机制:用纳米药物复合物mPEG-CS-cRGD/Bmi-1RNAi-PTX对CSC进行作用,以纳米药物复合物的各组分作为对照,具体分为磷酸盐缓冲液组（Control组）,游离紫杉醇（Free PTX组）,纳米紫杉醇组（mPEG-CS/PTX组）,纳米cRGD肽紫杉醇组（mPEG-CS-cRGD/PTX组）,实验组为纳米药物复合物组。用各组药物分别干预CSC,用蛋白质印迹法（western blot,WB）和qPCR检测Bmi-1基因,干性基因（C-myc、Nanog、Oct-4、Sox-2）,凋亡相关基因（Bcl-2、Bax、Caspase-3）,黏附浸润基因（ITG av）蛋白和mRNA水平,计算纳米药物复合物对上述基因表达的抑制程度或促进程度;用GraphPad Prism 8.0软件进行统计学分析和作图;3.使用STRING在线数据库和GEPIA在线数据库探索与Bmi-1具有显著相关性的基因和蛋白,预测Bmi-1与细胞凋亡之间的潜在机制。结果:1.流式细胞术结果显示喉癌Hep-2细胞系中的干细胞比例从富集前的0.4%提高到富集后的11.4%;平板克隆形成实验结果显示富集所得喉癌干细胞的克隆形成率（CFE）显著高于未富集的喉癌细胞（29.167±3.965 VS 16.333±3.520,P=0.027）;细胞成球实验结果显示富集所得喉癌干细胞的细胞球形成效率（SFE）显著高于未富集的喉癌细胞（2 6±0.232 VS 0.9±0.198,P=0.031）;富集所得干细胞的干性基因C-myc、Nanog、Oct-4、Sox-2的相对表达量均高于未富集细胞:富集前C-myc,Nanog,Oct-4,Sox-2蛋白的相对表达量分别为0.456±0.020,0.676±0.008,0.452±0.011,0.896±0.013;mRNA的相对表达量分别为 1.005±0.017,1.032±0.016,1.013±0.047,1.008±0.021;富集后C-myc,Nanog,Oct-4,Sox-2蛋白的相对表达量分别为 1.043±0.047,1.020±0.020,1.024±0.026,1.004±0.021;mRNA的相对表达量分别为2.076±0.019,1.274±0.082,1.772±0.155,1.499±0.167;2.纳米药物复合物mPEG-CS-cRGD/Bmi-1RNAi-PTX对喉癌干细胞的干性基因的抑制作用高于mPEG-CS-cRGD/PTX、mPEG-CS/PTX、Free PTX、Control组。纳米药物复合物干预喉癌干细胞后,干性相关C-myc、Nanog、Oct-4、Sox-2蛋白的相对表达量均降低,分别为0.405±0.027、0.413±0.020、0.402±0.020、0.408±0.024,mRNA的相对表达量均降低,分别为0.405±0.011、0.428±0.010、0.396±0.011、0.393±0.012;3.纳米药物复合物对喉癌干细胞Bmi-1基因表达有显著的沉默效果;对促凋亡基因Bax和Caspase-3有显著上调作用;对抗凋亡基因Bcl-2和黏附浸润基因ITG av有显著下调作用。纳米药物复合物干预喉癌干细胞后,Bmi-1基因的mRNA相对表达量为0.402±0.020;凋亡相关Bcl-2、Bax、Caspase-3蛋白的相对表达量为0.546±0 002、1.003±0.022、1.008±0.025,mRNA的相对表达量为0.403±0.005、1.014±0.015、1.012±0.016;黏附浸润相关ITG av蛋白的相对表达量为0.560±0.007,mRNA的相对表达量为0.428±0.002;4.通过STRING数据库和GEPIA数据库分析显示Bmi-1基因与其下游的PHCl基因表达呈正相关,且PHCl基因与Bcl-2基因表达呈正相关。结论:紫杉醇成功富集喉癌干细胞,富集所得的细胞具有明显的干细胞特性,其增殖生长能力和干性相关基因表达程度显著高于未富集的细胞。纳米药物复合物mPEG-CS-cRGD/Bmi-1RNAi-PTX对喉癌干细胞有显著抑制作用,其可能通过抑制Bmi-1下游的PHC1从而抑制Bcl-2,最终促进细胞凋亡;纳米药物复合物抑制喉癌干细胞的干性基因和黏附浸润基因表达。