【摘 要】
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背景:多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome,PCOS）是严重影响着PCOS患者的身心健康的内分泌疾病之一。PCOS常导致育龄期女性发生卵泡发育和成熟异常,是女性不孕症的主要原因之一。微囊泡（Microvesicles,Mvs）作为新型的细胞间通讯工具,以质膜直接出芽的方式,携带这miRNA在病理生理中发挥重要作用,与以质膜内陷形成的外泌体有着相似的功能。PCOS患者的
【基金项目】
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贵州省科技厅基金（[2017]7104）； 贵州省中医药管理局（QZYY2018072）； 贵州省科技厅科技成果应用与产业化项目（20194447）； 遵义医学院博士基金（201704）；
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背景:多囊卵巢综合征（Polycystic ovary syndrome,PCOS）是严重影响着PCOS患者的身心健康的内分泌疾病之一。PCOS常导致育龄期女性发生卵泡发育和成熟异常,是女性不孕症的主要原因之一。微囊泡（Microvesicles,Mvs）作为新型的细胞间通讯工具,以质膜直接出芽的方式,携带这miRNA在病理生理中发挥重要作用,与以质膜内陷形成的外泌体有着相似的功能。PCOS患者的血清外泌体中具存在大量差异表达显著的miRNA,且与PCOS疾病和卵泡发育密切相关。近年来的PCOS微囊泡研究发现,其浓度在循环血液中呈上升趋势。但目前尚不清楚PCOS患者微囊泡中是否存在参与PCOS疾病和卵泡发育过程的miRNA。循环血液来源微囊泡miRNA可能是PCOS疾病研究的新思路。目的:描述PCOS血清微囊泡特征和检测其浓度;建立PCOS血清微囊泡miRNA差异表达谱并进行生物信息学分析;观察通过尾静脉注射PCOS血清微囊泡,能否诱导野生型ICR雌鼠产生类PCOS表型。方法:1.收集2020年5月-2021年6月在遵义医科大学附属医院生殖中心就诊的患者血清。实验组为确诊PCOS的患者（50例）,对照组为因单纯输卵管因素导致不孕症的非PCOS患者（50例）。2.采用差速离心法提取微囊泡,通过透射电子显微镜和纳米粒追踪分析（NTA）进行微囊泡形态观察和尺度测量分析,采用蛋白免疫印迹法检查CD63的表达。3.通过miRNAs高通量测序方法构建血清微囊泡miRNA表达谱,采用q RT-PCR验证差异表达显著的miRNAs。采用R软件cluster Profiler对差异表达显著miRNAs的靶基因进行GO分析和KEGG通路和Reactome通路分析;4.采用尾静脉注射的方法,向8-9周龄野生型ICR雌鼠体内注入PCOS患者血清微囊泡悬液100μL。连续监测动情周期;注射48h后取卵巢,制作卵巢HE染色切片观察卵巢结构;采用免疫组化方法检测与PCOS炎症相关的蛋白NF-κB和WNT5A在ICR雌鼠卵巢内表达及定位。实验组注入PCOS患者血清微囊泡,对照组注入非PCOS患者血清微囊泡,空白组注入100μL PBS。结果:1.血清微囊泡镜下呈大小不一的圆形或椭圆形双层膜结构,可表达膜表面抗原分子CD63。PCOS组总的纳米颗粒浓度比对照组高1.87倍（PCOS组9.58×10~8particles/m L,对照组5.12×10~8particles/m L）,其中PCOS组以小直径为主。2.PCOS组与对照组血清微囊泡中检测到730个miRNAs,存在19条显著差异表达的微囊泡miRNAs（P＜0.05,|-log2（Flod Change）|≥1.5）,其中8条表达上调,11条表达下调;q RT-PCR验证结果表示,hsa-mi R-486-3p、hsa-mi R-125b-1-3p、hsa-mi R-885-3p、hsa-mi R-125b-2-3p与测序结果相同。3.19条显著差异表达的微囊泡miRNAs通过预测数据库筛选出195个靶基因;这些miRNAs可能参与Wnt信号通路、细胞周期、细胞代谢调控等生物过程,富集通路包括白细胞介素家族、核转录因子κB（nuclear factor kappaβ,NF-κB）、MAPK信号通路、TGF-β信号通路、胆固醇代谢相关通路等、炎症信号途径、胰岛素分泌的调节以及癌症miRNA通路及昼夜节律等通路。4.注射PCOS患者血清微囊泡,可诱导野生型ICR雌鼠产生动情周期紊乱,主要体现在动情期延长或间期延长。卵巢HE切片染色切片显示,各组卵巢结构正常,各级卵泡形态正常。NF-κB和WNT5A蛋白主要定位于雌鼠卵泡颗粒细胞胞质内,其中NF-κB蛋白在核内表达阳性。在注射PCOS血清微囊泡组雌鼠的卵巢中的大卵泡和小卵泡中,WNT5A蛋白均呈现阳性表达。NF-κB蛋白在雌鼠卵巢卵泡颗粒细胞胞质和核内表达,阳性信号颜色由深到浅为:实验组＞对照组＞空白组。结论:1.PCOS组血清微囊泡浓度较高,在100-400nm范围内且存在更多较小直径的微囊泡。2.PCOS患者血清微囊泡中差异表达的miRNA,参与调节的包括炎症、脂代谢、胰岛素抵抗、昼夜节律和癌症等通路信号。这些差异表达的血清微囊泡miRNA可能会增加PCOS风险,并可能参与调控卵泡发育的相关基因。3.PCOS患者血清来源的微囊泡可诱导野生型ICR雌鼠产生轻微的类PCOS样表型。
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