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肾康注射液是由大黄、黄芪、丹参和红花四味中药水提精制成的中药复方注射剂，主要用于治疗慢性肾功能衰竭证属湿浊血瘀。由于该方成分复杂，前期研究未建立该制剂药效物质的含量测定方法，因此，建立同时测定肾康注射液中9种化合物（没食子酸、丹参素钠、原儿茶醛毛蕊异黄酮葡萄糖苷、迷迭香酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素及大黄酚)含量的HPLC-UV方法，以及检测羟基红花黄色素A的LC-MS/MS方法，将该方法用于15个不同批次的含量测定，方法稳定可靠，为制定肾康注射液的质量标准提供了重要参考依据。 到目前为止，没有文献报道肾康注射液有效成分的体内药动学特征。本课题采用LC-MS/MS法对大鼠血浆中的大黄酸、大黄素、迷迭香酸、原儿茶醛、羟基红花黄色素A和毛蕊异黄酮葡萄糖苷进行浓度测定，并开展体内药动学研究。 本文主要从以下几方面进行了论述： 1.肾康注射液指纹图谱的建立及含量测定 目的：建立同时测定肾康注射液中9种化合物（没食子酸、丹参素钠、原儿茶醛毛蕊异黄酮葡萄糖苷、迷迭香酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素及大黄酚）含量的HPLC-UV 方法：HPLC-UV测定方法，色谱柱:DikmaInspire-C18 column(150×4.6mm，5μm):流动相:乙腈(A)-水（1％冰醋酸）(B)，A相的含量随时间变化为8％～10％(0～10min)、10％～17％(10～20min)、17％～20％(30～65 min)、30％～80％(65～110min);流速:1.0ml/min,检测波长:280nm，柱温:30℃。LC-MS/MS测定羟基红花黄色素A的检测条件:色谱柱:Phenomenex-C18column(150×4.6mm，4m);流动相:甲醇:水(15 mmol·L-1醋酸铵，0.02％甲酸)=85∶15(v/v)，流速:0.5ml/min;柱温:40℃;运行时间6min。离子检测方式:MRM;离子极性:负离子(Negative);检测对象:羟基红花黄色素Am/z611.2→491.2，裂解电压:230V;碰撞能:25eV;双氯芬酸钠(内标物)m/z294→250，裂解电压:80V;碰撞量:4eV。 结果：HPLC-UV测定9种化合物，没食子酸、丹参素钠、原儿茶醛、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、迷迭香酸、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素及大黄酚，在110min内基线分离，其质量浓度分别在104-1260μg/ml、132.1-1981.5μg/ml、10.56-31.66μg/ml、3.29-17μg/ml、2.02-15.57μg/ml、1.16-3.7μg/ml、2.25-19.64μg/ml、0.12-1.61μg/ml、0.12-1.41μg/ml内线性关系良好，R2分别为0.999、0.998、0.999、0.999、0.996、0.999、0.995、0.999、0.999。平均加样回收率在96.88％～105.74％，RSD均低于7.2％。LC-MS/MS法测定羟基红花黄色素A，在20 min内基线分离，浓度0.02-1.01μg/ml内线性关系良好，R2=0.997，平均加样回收率在99.68％～102.01％，RSD低于3.2％。 结论：该方法可用于肾康注射液中化合物的含量测定;不同批次制剂含量有显著差异。 2.大鼠体内的药动学研究 目的：本试验研究旨在建立同时测定静脉注射肾康注射液后大鼠血浆中大黄酸、大黄素、迷迭香酸、原儿茶醛、羟基红花黄色素A和毛蕊异黄酮葡萄糖苷的药物浓度，并开展体内药动学研究。 方法：采用LC-MS/MS方法，色谱柱:Phenomenex-C18column(150×4.6mm，4μm)。同时测定大黄酸、大黄素、迷迭香酸的检测条件:流动相:乙腈:水(10mmol/L醋酸铵，0.04％甲酸)=84∶16(v/v)，流速:0.5 ml/min;柱温:40℃;运行时间:5min。质谱条件:离子检测方式:MRM;离子极性:负离子(Negative);检测对象:大黄酸m/z283.1→239.1，裂解电压:70V，碰撞能:7eV;大黄素m/z269.1→225，裂解电压:130V，碰撞能:27eV;迷迭香酸m/z358.8→161，裂解电压:90V，碰撞能:12eV;双氯芬酸钠(内标物)m/z294→250，裂解电压:80V，碰撞能:4eV。测定原儿茶醛的检测条件:流动相:甲醇:水(0.04％甲酸)=87∶13(v/v)，流速:0.5ml/min;柱温:40℃;运行时间:6min。离子检测方式:MRM;离子极性:负离子(Negative);检测对象:原儿茶醛m/z137→108、裂解电压:100V;碰撞能:23eV;双氯芬酸钠(内标物)m/z294→250，裂解电压:80V，碰撞能:4eV。测定羟基红花黄色素A的检测条件:流动相:甲醇:水(15mmol· L-1醋酸铵，0.02％甲酸)=85∶15(v/v)，流速:0.5ml/min;柱温:40℃;运行时间6min。离子检测方式:MRM;离子极性:负离子(Negative);检测对象:羟基红花黄色素Am/z611.2→491.2，裂解电压:230V;碰撞能:25eV;双氯芬酸钠(内标物)m/z294→250，裂解电压:80V;碰撞量:4eV。测定毛蕊异黄酮葡萄糖苷的检测条件:流动相:乙腈:水(15mmol/L醋酸铵，0.02％甲酸)=85∶15(v/v)，流速:0.4ml/min;柱温:40℃;运行时间:5min。离子检测方式:MRM;离子极性:正离子(Positive);检测对象:毛蕊异黄酮葡萄糖苷m/z447→285，裂解电压:120V，碰撞能:10eV;酮洛芬(内标物)m/z255→209，裂解电压:80V，碰撞能:8eV。 结果：大黄酸在25.15-2515.0ng/ml、大黄素在2.01-1004.5ng/ml、迷迭香酸在9.98ng/ml～4990ng/ml、原儿茶醛在0.5ng/ml～100.2ng/ml、羟基红花黄色素A在5.04ng/ml～1007.0ng/ml、毛蕊异黄酮葡萄糖苷在1.004ng/ml～301.2ng/ml内线性关系良好。最低定量限(LLOQ)分别为25.15ng、2.01ng、9.98ng、0.5ng、5.04ng和1.004ng。批内和批间精密度良好，均小于15％，样品回收率均大于80％，均符合生物样本检测要求。 结论：该方法灵敏度高，操作简单，成功用于肾康注射液中六种化合物的药体内动力学研究。