副猪革拉瑟氏菌（Glaesserella parasuis,GPS）是猪革拉瑟氏病（Glasser’s disease）的病原体,对养猪业造成较高的经济损失。本研究利用原核表达纯化的GPS HbpA重组蛋白（r HbpA）免疫BALB/c小鼠,制备了抗r HbpA蛋白的单克隆抗体并鉴定了相对应的抗原表位,基于此抗原表位建立了检测抗体的间接ELISA方法。1.副猪革拉瑟氏菌HbpA蛋白单克隆抗体制备及鉴定本研究成功表达了可溶性的GPS r HbpA蛋白,并免疫BALB/c小鼠,制备并筛选出3株杂交瘤细胞（分别命名为5D11、2H81和4F2）,经间接ELISA及间接免疫荧光试验对3株杂交瘤细胞进行初步鉴定,结果表明杂交瘤细胞5D11与抗原反应性较好,选择其进行抗体制备与鉴定。单克隆抗体5D11属于Ig G1亚型,κ链;免疫印迹结果显示5D11能特异性识别GPS中的天然HbpA蛋白以及r HbpA蛋白;在组织免疫荧光和免疫组化试验中能够较好的检测出感染组织的GPS。2.副猪革拉瑟氏菌HbpA蛋白抗原表位鉴定将HbpA进行重叠截短,通过免疫印迹方法探究单克隆抗体5D11与系列截短蛋白的反应性,结果表明其抗原表位初步定位于aa324-LPQYEFNLEKAKALLA-339;逐步缩短左右两端的氨基酸后,发现其能够识别到的最小表位为325-PQYEFNLEKAKALLA-339（命名为EP-5D11）。同源性分析显示,EP-5D11序列在GPS菌株中均高度保守。3D结构分析表明,EP-5D11的氨基酸之间距离较近并暴露在HbpA蛋白的表面。3.基于HbpA蛋白抗原表位5D11间接ELISA方法的建立建立基于EP-5D11的间接ELISA方法,优化反应条件:包被抗原最佳浓度为1μg/100μl,血清稀释度为1:200,最佳包被条件为37°C孵育2 h;最佳封闭条件为5%脱脂奶粉孵育2 h;一抗最佳孵育时间为1 h;二抗最佳条件为1:5000孵育30 min;TMB最佳显色时间15 min。检测结果OD450≥0.292为阳性;利用建立的EP-5D11间接ELISA检测实验室保存的APP、PM、SS血清以及试剂盒中的HCV、PCV2、PRRSV和PEDV的标准阳性血清,结果均为阴性;灵敏性试验中EP-5D11间接ELISA能够检测到的阳性血清最高稀释度为1:1600;重复性试验表明,批内和批间重复性较好,变异系数均小于10%。用建立的EP-5D11间接ELISA对93份临床血清进行检测,与商品化试剂盒相比,阳性符合率为94.3%（33/35）,阴性符合率为94.8%（55/58）。