人工转录激活因子激活小鼠内源Oct4基因的研究

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基因组靶向修饰是研究生物分子遗传与进化中的一种新方法,具有巨大的应用前景。传统基因组修饰是利用自发同源重组或逆转录病毒法,引入随机的突变,效率极低且存在安全隐患。现代的基因组修饰利用基因组靶向工具,不仅可以在特定的位点引入突变,还可以基因敲除、基因敲入以及基因表达调控。TALE和CRISPR/Cas9系统是新兴的基因组靶向工具。TALE通过串联的重复模块识别特异的DNA。CRISPR/Cas9系统中的sgRNA识别DNA,并介导sgRNA-Cas9结合在DNA上。Oct4基因只在早期细胞中表达,对早期细胞发育、维持细胞全能性起重要作用,也是体细胞重编程过程中的最重要的转录因子。本研究利用TALE和CRISPR/Cas9系统,靶向小鼠Oct4基因转录起始位点上游序列。构建人工TALE转录激活因子及人工Cas9转录激活因子,激活小鼠胚胎成纤维细胞中内源Oct4基因的表达,为iPS的诱导提供一种安全的新方法。4个分别识别A、C、T、G四碱基TALE单体质粒,利用Golden Gate方法,使任意四个单体质粒按顺序依次相连,构建出256个能识别任意四联碱基的TALE四聚体库。根据Oct4基因转录起始位点上游-88~-101、-1042~-1055、-1561~-1574位点的序列设计了3个人工TALE转录激活因子。在TALE四聚体库的基础上,通过不完全匹配引物扩增,利用Golden Gate方法,再与转录激活因子骨架酶切-连接,构建出3个13.5重复的人工TALE转录激活因子TALE-TF-Oct41、TALE-TF-Oct42、TALE-TF-Oct43。TALE-TF-Oct41、TALE-TF-Oct42、TALE-TF-Oct43电转染原代MEF,分别上调MEF内源Oct4基因418倍、2.8倍和5倍。TALE-TF-Oct41转染的MEF中表达的Oct4,可以通过WesternBlot检出。利用靶向Oct4转录起始位点上游-109~-128、-200~-220、-301~-322位点的sgRNA载体pll3.7-hU6-sgRNAa、pll3.7-hU6-sgRNAb、pll3.7-hU6-sgRNAc,分别与pLenti-EF1α-dCas9-TF共同电转染原代MEF,上调MEF内源Oct4基因2.3倍、1.5倍、2.2倍。
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