论文部分内容阅读
背景:瘢痕疙瘩（Keloid）作为整形外科的常见病和多发病,是一种病理特征表现为细胞外基质（ECM）过度沉积的良性皮肤肿瘤。目前临床上仍缺乏有效的根治手段,其病因及发病机制还有待深入研究。早期生长反应-1（EGR1）是一种重要的锌指转录因子,被认为是纤维化的关键介质之一。EGR1在多种细胞类型中参与包括细胞增殖、迁移、侵袭、细胞分化及凋亡等诸多重要的生理过程,是皮肤瘢痕预防的潜在靶点。Micro RNAs（miRNAs）是一种长度为18-22个核苷酸的非编码RNA序列。作为表观遗传修饰的重要调控分子,miRNA主要通过参与靶基因转录后调控影响各种病理生理过程,在瘢痕疙瘩的发病机制也中起着至关重要的调控作用。我们利用瘢痕疙瘩基因表达谱数据结合生信分析预测miR-183-5p通过靶向调控EGR1参与瘢痕疙瘩的发生发展。然而,目前miR-183-5p/EGR1在瘢痕疙瘩中的作用机制尚不明确。目的:观察miR-183-5p/EGR1差异表达对瘢痕疙瘩原代成纤维细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡等表型的影响;证实miR-183-5p与EGR1之间的靶向调控关系,为瘢痕疙瘩精准医疗提供新的理论依据。方法:本研究以瘢痕疙瘩为研究对象,通过组织块法培养瘢痕疙瘩原代成纤维细胞（KF）及正常皮肤原代成纤维细胞（NF）;RT-PCR检测KF及NF中miR-183-5p的表达差异;通过转染miR-183-5p模拟物（mimic）/抑制剂（inhibitor）或pc DNA3.1-EGR1质粒/小干扰RNA（si EGR1）构建miR-183-5p或EGR1差异表达细胞模型;通过CCK-8实验检测细胞增殖情况;通过划痕实验检测细胞迁移能力的变化;通过Transwell实验检测细胞迁移及侵袭能力变化;通过流式细胞术测量细胞凋亡变化。RT-PCR及Western Blot实验检测EGR1及其他相关基因的表达变化;通过双荧光素酶报告实验证实miR-183-5p与EGR1之间的靶向调控关系。结果:1.瘢痕疙瘩中miR-183-5p表达下调瘢痕疙瘩组织及正常皮肤组织miRNA表达谱芯片检测结果显示:与正常皮肤组织相比,瘢痕疙瘩组织中发现247个miRNA差异表达（134个上调,113个下调）（p＜0.05,倍数变化＜0.5）,其中miR-183-5p在瘢痕疙瘩组织中表达明显下调。组织块法培养人瘢痕疙瘩组织及正常皮肤组织原代成纤维细胞,并利用RTPCR检测原代细胞中miR-183-5p的表达,结果显示:与NF细胞相比,KF细胞中miR-183-5p的表达显著下调（p＜0.001）。2.miR-183-5p对瘢痕疙瘩原代成纤维细胞表型的影响通过瞬时转染miR-183-5p模拟物上调其在瘢痕疙瘩原代成纤维细胞（KF）中的表达以进行功能获得性实验,结果显示,miR-183-5p在转染模拟物后24h及48h表达明显上调（p＜0.05）。CCK-8实验结果显示:miR-183-5p模拟物组KF在转染后24h、48 h及72 h生长速度明显滞后于对照组（p＜0.05）。划痕实验结果显示:36h后miR-183-5p模拟物组KF迁移率明显小于对照组（p＜0.01）。Transwell迁移及侵袭实验结果显示:24h后miR-183-5p模拟物组迁移细胞数明显少于对照组（p＜0.01）,侵袭实验结果一致（p＜0.001）。流式细胞术检测结果提示:miR-183-5p模拟物组KF凋亡率明显高于对照组（p＜0.05）。Western Blot实验结果提示转染miR-183-5p 48h后Caspase3剪切体在蛋白水平表达上调（p＜0.05）。3.EGR1对瘢痕疙瘩原代成纤维细胞表型的影响通过瞬时转染小干扰RNA（si EGR1）下调瘢痕疙瘩原代成纤维细胞（KF）中EGR1的表达,RT-PCR及Western Blot验证沉默效率。随后进行功能获得性实验,CCK-8实验结果显示:si EGR1组KF在转染后24h、48 h及72 h生长速度明显滞后于对照组（p＜0.05）。划痕实验结果显示:36h后si EGR1组KF迁移率明显小于对照组（p＜0.05）。Transwell迁移及侵袭实验结果显示:24h后si EGR1组迁移、侵袭细胞数均明显少于对照组（p＜0.05）。流式细胞术检测结果提示:si EGR1组KF凋亡率明显低于对照组（p＜0.001）,同时Caspase3剪切体在蛋白水平表达下调（p＜0.05）。RT-PCR及Western Blot检测转染si EGR1后ECM相关基因表达变化,结果提示纤维化相关基因（如CollagenⅠ、CollagenⅢ）在m RNA及蛋白水平均表达下调。4.miR-183-5p与EGR1靶向调控关系的研究利用生物信息学预测网站预测miR-183-5p与EGR1靶向结合位点,双荧光素酶报告实验验证miR-183-5p能够与EGR1 3’UTR上的预测位点结合。RT-PCR和Western Blot实验验证转染miR-183-5p模拟物后,EGR1蛋白及m RNA水平的表达均明显下调,提示miR-183-5p靶向抑制EGR1的表达。为了进一步验证这一结论,我们设计了回返实验。首先,同时转染miR-183-5p模拟物及pc DNA3.1-EGR1,利用RT-PCR和Western Blot实验检测ECM相关基因的表达,结果显示:单独转染pc DNA3.1-EGR1后ECM相关基因表达上调,同时转染miR-183-5p模拟物及pc DNA3.1-EGR1可以消除pc DNA3.1-EGR1对ECM相关基因表达的促进作用。随后,同时转染miR-183-5p inhibitors及si EGR1下调EGR1及miR-183-5p的表达水平,通过transwell实验检测迁移及侵袭能力的变化,结果显示:转染miR-183-5p inhibitors可以减弱si EGR1对细胞迁移及侵袭能力的抑制作用。结论:1.miR-183-5p在瘢痕疙瘩中表达下调,过表达miR-183-5p能够抑制瘢痕疙瘩原代成纤维细胞增殖,降低细胞迁移及侵袭能力,同时促进细胞凋亡。2.沉默EGR1可显著抑制瘢痕疙瘩原代成纤维细胞增殖、迁移、侵袭、凋亡,同时下调细胞外基质相关基因的表达。3.miR-183-5p能够与EGR1的3’UTR结合,通过靶向抑制EGR1参与调节瘢痕疙瘩的发生发展。