背景牙髓炎（pulpitis）是口腔最常见的疾病,是一种由细菌感染激活宿主免疫防御反应引起的以疼痛为主要症状的炎症性疾病,常常由龋病、创伤等未及时有效治疗发展而来。目前,牙髓炎的治疗首选根管治疗,通过摘除牙髓,清除感染来达到消炎止痛的目的。然而,根管治疗有其局限性:（1）治疗需要摘除牙髓,造成牙齿血供缺失、感觉丧失、脆性增加;（2）治疗过程中不可避免造成牙体组织受损,从而降低抗折力和增加牙齿劈裂风险;（3）治疗后牙齿变色,影响美观;（4）由于根管系统的复杂性,即使材料和设备不断改进,根管治疗的成功率仍然只能达到85%左右。因此,寻找更优的牙髓炎防治方法有其紧迫性。临床上虽然已将血运重建术用于牙髓再生,但其主要适用于年轻恒牙,适应证范围狭窄。因此,进一步揭示牙髓炎的发病机制并寻找治疗靶点,进而实现早期炎症控制、阻断炎症进展、促进牙髓再生、恢复牙髓活力,将治疗策略由“去髓”转变为“保髓”具有非常重要的临床意义。piRNAs是长度约为26-33 nt的一类具有调控基因表达功能的非编码小RNA。通过与PIWI蛋白特异性结合发挥其生物学作用,在转录后水平沉默转座子机制以维持基因组稳定性和完整性,对细胞分化、胚胎发育、基因转录以及转录后的修饰等起重要调控作用。虽然piRNAs在炎症、免疫方面的研究目前尚在起步阶段,但其在炎症的发生、发展中起着重要作用,揭示牙髓炎发生发展中piRNAs的变化和功能对牙髓炎的防治有临床和科学指导意义。目的本研究通过采集人的牙髓炎样本进行高通量测序和生物信息学分析,揭示牙髓炎发生发展中piRNAs表达谱、筛选差异piRNAs并对这些差异表达的piRNAs进行靶基因预测,进一步揭示牙髓炎中的piRNA-mRNA的关系和分子调控网络体系,为阐明牙髓炎病因和发病机制提供科学依据。材料与方法本课题分为三部分:1.piRNAs在人牙髓炎中的表达谱分析（1）收集临床牙髓炎组织样本和正常牙髓组织样本进行高通量测序和组织病理学分析;（2）高通量测序获得差异表达piRNAs并利用mi Randa和RNAhybrid进行靶基因预测、靶基因GO富集分析和KEGG通路分析;2.小鼠实验性牙髓炎模型的建立（1）利用开髓开放法在C57BL/6小鼠双侧上颌第一磨牙咬合面进行髓腔暴露,来建立小鼠牙髓炎模型,分别在髓腔暴露后0 h、4 h、8 h、16 h处死取材;（2）分离上颌骨用于Micro-CT观察、HE染色、量化分析来分析牙髓炎的发生、发展和转归。3.piR-36241、piR-36340及其靶向mRNA在人和小鼠牙髓炎中的表达和功能预测（1）采用人的牙髓炎样本对|log2FC|大于2的piRNAs及其靶基因进行RT-q PCR验证和功能预测;（2）采用小鼠牙髓炎组织,对本部分步骤（1）中获得的差异piRNAs及其靶基因进行RT-q PCR验证分析。结果1.piRNAs在人牙髓炎中的表达谱分析（1）HE染色显示牙髓发生炎症时,成牙本质细胞排列紊乱,牙髓血管扩张,红细胞渗出,部分牙髓出现坏死,炎性细胞包括中性粒细胞和巨噬细胞数量明显多于正常牙髓组织。牙髓炎样本中TNF-α和IL-10均呈现显著高表达,P<0.05。（2）高通量测序结果表明,在牙髓组织中有692个已知的piRNAs,其中,牙髓炎组有453个piRNAs表达,而正常牙髓组织中有574个piRNAs表达。其中15个上调piRANs和6个下调piRNAs统计学差异显著。（3）通过对差异表达的piRNAs及其靶基因进行联合分析,KEGG通路分析结果显示差异表达的piRNAs的靶基因主要富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、造血细胞谱系和趋化因子信号通路;GO富集结果显示,信号转导和多细胞生物发育分别在上调和下调piRNAs靶基因生物学过程中富集程度最高;细胞膜在细胞组分中富集程度最高;受体活性和钙离子结合分别是上调和下调piRNAs靶基因分子功能中富集程度最高。2.小鼠实验性牙髓炎模型的建立（1）本课题使用开髓开放法建立小鼠牙髓炎模型,根据不同时间段依次处死小鼠,0 h、4 h、8 h和16 h组的HE染色结果表明,牙髓开放后随着时间的延长,炎症逐渐由冠部向牙根发展,直至牙髓完全空泡性变和坏死。小鼠牙髓炎表现为成牙本质细胞排列紊乱,血管扩张,红细胞渗出,部分牙髓出现坏死,4 h组、8 h组和16 h组炎症细胞数目分别为0 h组的2.4倍、3.3倍和1.3倍。病理进程与人牙髓炎基本一致。（2）对0 h、4 h、8 h和16 h组所取上颌骨的micro-CT扫描显示,开髓位置处于上颌第一磨牙中央窝,开髓孔大小一致,符合实验要求。3.piR-36241、piR-36340及其靶向mRNA在人和小鼠牙髓炎中的表达和功能预测（1）临床测序所得到的|log2FC|大于2的piRNAs分别为piR-36241、piR-36340、piR-36252和piR-31686。RT-q PCR显示piR-36241和piR-36340在人牙髓炎中表达显著高于正常牙髓组织。对piR-36241和piR-36340的靶基因进行验证后得到GFRA1、FAM19A3、LYPD6、MAPT、NOS1、ADGRG2、AJAP1、SPOCK1、SMPD3、SNAP91共10个基因可能是piR-36241调控牙髓炎的潜在靶基因,CACNA2D2可能是piR-36340调控牙髓炎的潜在靶基因。（2）利用小鼠牙髓炎样本对人牙髓炎样本验证所得差异piRNAs与靶mRNA进行RT-q PCR验证,结果显示piR-36241和piR-36340在小鼠牙髓炎中表达显著高于正常牙髓组织,与临床样本验证结果一致。piR-36241和piR-36340的靶基因经小鼠牙髓炎组织验证后,最终获得piR-36241的9个靶基因GFRA1、LYPD6、MAPT、NOS1、SMPD3、SNAP91、SPOCK1、ADGRG2、AJAP1在小鼠牙髓炎中。结论本研究在炎症牙髓组织和正常牙髓组织中检测到piRNAs并预测其靶基因,发现piR-36241和piR-36340在人和小鼠牙髓炎中均显著高表达,piR-36241的9个靶基因GFRA1,LYPD6,MAPT,NOS1,SMPD3,SNAP91,SPOCK1,ADGRG2,AJAP1在人和小鼠牙髓炎中均显著下调,piR-36340的靶基因在小鼠牙髓炎中表达水平差异均不显著,这提示piR-36241可能在牙髓炎的发生发展过程中发挥作用。使用开髓开放法可以有效建立小鼠实验性牙髓炎模型,其组织病理学表现与临床吻合,表明该模型较好地模拟了人牙髓炎发生发展过程,模型重复性好,效果稳定,联合小鼠牙髓炎组织病理和分子病理评价标准,该模型有望在牙髓炎的防治研究中有更好的应用前景。这些新发现仍需要后续深入研究,进一步阐明piR-36241在牙髓炎进程中的作用、功能和分子网络机制,为临床牙髓炎的防治和牙髓再生提供科学指导数据。