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本论文以重要的海水养殖经济鱼大菱鲆为实验材料,采用分子克隆与体外重组技术,对影响鱼类生长和抗病的重要基因胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、抗菌肽hepcidin与IGF-I的重组基因hep-IGF、CXC趋化因子S457和CC趋化因子KC70进行了克隆和原核表达的研究,并采用不同的活性测定法对几种蛋白表达产物进行了活性研究。1.大菱鲆胰岛素样生长因子-I的克隆、原核表达及促生长活性分析通过RT-PCR方法从大菱鲆肝组织克隆了胰岛素样生长因子-I(IGF-I)成熟肽片段,分析表明此成熟肽由70个氨基酸残基组成,含有3个链内二硫键。经序列比对,发现大菱鲆IGF-I是高度保守的蛋白,其成熟肽的氨基酸序列与牙鲆、金鲈、草鱼、鸡、人的相似性分别为100%、98%、86%、79%、76%。将扩增片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,实现了IGF-I成熟肽和GST蛋白在E.coli BL21(DE3)plysS中的的融合表达。融合蛋白分子量约为34kD,诱导4h时占菌体总蛋白的59%,主要以包涵体形式存在。Western-blotting免疫印迹表明融合蛋白可以特异性地被anti-GST抗体识别。对菌体进行超声破碎,收集包涵体并用1%Triton-X100+1%DOC洗涤,经6mol/L盐酸胍变性溶解及脉冲法稀释复性(0.5 mol/L L-Arginine, 1.0 mol/L GSH,0.2 mol/LGSSG.)后,通过GSTrap FF亲和预装柱纯化,获得了电泳分析纯的融合蛋白。以细胞增殖实验检测蛋白生物活性,结果显示纯化蛋白能促进大菱鲆肾脏细胞的增殖。2.大菱鲆融合蛋白hepcidin-IGF的重组表达及活性分析以实验室构建的pMD-hep-IGF质粒为模板进行PCR,在片段上添加EcoR I和Xho I酶切位点。经过酶切、连接和转化,将扩增的hep-IGF片段克隆至pGEX-4T-1重组表达载体,并转化E.coli BL21(DE3)plysS宿主菌。阳性重组克隆用IPTG进行不同时间的诱导,结果表明hep-IGF重组蛋白在大肠杆菌中获得了高效表达。随着诱导时间的增加,重组蛋白的表达量增加,在诱导后7h时达最大,大约占大肠杆菌总蛋白的55%。western-blotting免疫印迹表明,重组菌所表达的融合蛋白可以特异性地被anti-GST抗体识别。对菌体进行超声破碎,收集上清过GSTrap FF亲和柱,获得了纯化的GST-hep-IGF重组蛋白。用液体抑制法验证hep-IGF融合蛋白的抑菌活性,结果表明大肠杆菌(ATCC25922)培养8h后,加重组蛋白的处理组与不加任何样品的处理组相比出现抑制效果。3.大菱鲆趋化因子S457和KC70的原核表达及趋化活性分析以大菱鲆肝脏cDNA为模板进行PCR,获得了S457和KC70成熟肽片段。序列比对发现这两种趋化因子与其他物种的CXC或CC趋化因子的相似性不高:大菱鲆S457与斑马鱼CXCL-C1c、鼠CXC L7、猪CXC L9、人CXC L5相似性分别为34%、39%、42%、39%;大菱鲆KC70与大黄鱼CC样趋化因子、大西洋鲑CCL19、斑马鱼CCL-C5a、鸡CCL19、人CCL19相似性分别为61%、39%、35%、45%、38%。将扩增片段克隆到原核表达载体pGEX-4T-1上,实现了融合表达。GST-S457融合蛋白分子量约为38.6kD,诱导4h时表达量最大,占菌体总蛋白的47.5%;GST-KC70融合蛋白分子量约为36.1kD,诱导4h时表达量最大,占菌体总蛋白的45.6%。Western-blotting免疫印迹表明融合蛋白可以特异性地被anti-GST抗体识别。对菌体进行超声破碎,收集上清过GSTrap FF亲和柱,纯化的蛋白进行趋化活性分析。结果显示当GST-S457重组蛋白浓度为0.1和1ug/mL时,与对照组相比具有显著差异(P<0.01),且后者趋化作用更明显;当GST-KC70重组蛋白浓度为10ug/mL时,与对照组相比具有显著差异(P<0.01)。