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研究背景:哮喘是一种由多种细胞及细胞因子参与介导的慢性气道炎症性疾病,以可逆性气流阻塞、气道高反应性（Airway hyperresponsiveness,AHR）、气道重塑（Airway remodeling）为主要特点。目前一线治疗方案为吸入性糖皮质激素,但是由于潜在副作用及激素抵抗的发生,探究并开发治疗哮喘的替代性药物迫在眉睫。哮喘的发生发展过程中涉及许多信号通路,通过精确识别这些致病途径的调节因子并靶向调控是目前治疗哮喘的新策略。PI3K/Akt信号通路对细胞生长和存活的许多方面都至关重要,该通路在调节免疫以及气道重塑中起到关键性作用,不仅如此,PI3K/Akt信号通路还参与Th17细胞介导的激素抵抗型哮喘的发生,因此该通路是哮喘等一系列慢性呼吸系统疾病的潜在治疗靶点。迄今为止,越来越多的证据表明多种天然化合物在治疗哮喘方面的潜力,胭脂素是从胭脂树的种子中分离出来的一种天然食用色素,具有抗肿瘤、抗炎和抗氧化、抗纤维化的药理学特性。然而,胭脂素在哮喘治疗中的应用有待进一步研究。方法:本实验主要分为三部分,第一部分通过Swiss Target Prediction数据库预测胭脂素的药物靶点,并利用R语言将药物靶点进行GO生物过程及KEGG细胞通路富集分析,利用Vina软件进行模拟使小分子化合物胭脂素与PI3K蛋白以最低自由能结合并获得分子对接的结果。第二部分使用过氧化氢（H2O2）或转化生长因子β1（TGF-β1）刺激下的MLE-12细胞构建哮喘体外模型,并利用酶联免疫吸附法（Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA）、细胞免疫荧光染色、蛋白质印迹法（Western blot）探究胭脂素对哮喘发挥保护作用的分子机制。第三部分单独利用卵清蛋白（Ovalbumin,OVA）或者联合完全弗氏佐剂（Complete Freund’s adjuvant,CFA）构建急性、慢性以及激素（Glucocorticoids,GCs）抵抗型哮喘小鼠模型。对于急性哮喘模型,24只BALB/C小鼠随机分为4组,并分笼标记,分别为空白对照组（OVA-,Bixin-）,模型组（OVA+,Bixin-）,胭脂素50组（OVA+,Bixin 50mg/kg）,胭脂素100组（OVA+,Bixin 100mg/kg）。对于GCs抵抗型哮喘小鼠模型,随机将30只BALB/C小鼠分为5组,并分笼标记,分别为空白对照组（OVA/CFA-,Bixin-,Dexa-）,模型组（OVA/CFA+,Bixin-,Dexa-）,地塞米松治疗组（OVA/CFA+,Bixin-,Dexa+）,胭脂素治疗组（OVA/CFA+,Bixin+,Dexa-）,地塞米松联合胭脂素治疗组（OVA/CFA+,Bixin+,Dexa+）。对于慢性哮喘模型,20只BALB/C小鼠随机分为4组,分别为空白对照组（OVA-,Bixin-）,模型组（OVA+,Bixin-）,胭脂素50组（OVA+,Bixin 50mg/kg）,胭脂素100组（OVA+,Bixin 100mg/kg）。基于上述三种哮喘模型,在完成造模及治疗过程后,使用全身体描标记系统测量小鼠气道高反应性,并采集各组小鼠肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid,BALF）,应用吉姆萨染色、ELISA测量炎症细胞分类及计数、细胞因子水平。收集小鼠肺组织,将左肺组织固定包埋后根据模型特点进行苏木精-伊红（HE）染色分析气道炎症及气道改变情况、过碘酸雪夫（PAS）染色分析杯状细胞增生情况、马松（Masson）染色分析胶原纤维沉积情况。右肺组织研磨后进行Western blot检测相关通路蛋白。结果:第一部分:胭脂素可以通过3个氢键与PI3K蛋白结合口袋的GLU-880、PHE-694、ARG-849氨基酸以最小自由能良好结合。结果表明胭脂素对于PI3K/Akt通路可能具有靶向性。第二部分:胭脂素以剂量依赖的方式抑制H2O2刺激下的MLE-12细胞的白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）和IL-1β炎症因子水平和NF-κB信号通路的激活,主要表现为抑制p65核内移,减少p65蛋白核内表达量。胭脂素预处理可以抑制由TGF-β1信号传导介导的MLE-12细胞中的E-钙黏蛋白（E-Cadherin）下调,以及N-钙黏蛋白（N-Cadherin）和α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）的上调。同时胭脂素处理抑制TGF-β1刺激导致的p-PI3K、p-Akt和pm TOR的蛋白表达增加,而对TGF-β1刺激的MLE-12细胞中磷酸化SMAD2和SMAD3的水平没有影响。这些发现表明胭脂素可有效抑制TGF-β1刺激下的PI3K/Akt通路的激活而不影响经典的的TGF-β1/Smad信号通路。第三部分:1.在OVA短期诱导的急性哮喘小鼠模型中,胭脂素治疗减轻了过敏性哮喘引起的气道高反应性,减少了小鼠气道内炎症细胞聚集,并且抑制了BALF中炎症因子IL-5、IL-13、IL-6、IL-1β的释放、缓解肺组织病理损伤及杯状细胞增生。同时,在胭脂素治疗后,OVA诱导的哮喘小鼠肺组织中p-IκBα和p65的水平降低,还抑制了p-PI3K、p-Akt和p-m TOR的蛋白表达。2.在OVA/CFA诱导的GCs抵抗型哮喘小鼠模型中,胭脂素治疗逆转了糖皮质激素抵抗状态,减轻气道高反应,减少气道内炎症细胞聚集及BALF中炎症因子IL-17A、肿瘤坏死因子-α（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、干扰素-γ（Interferon-γ,IFN-γ）和IL-6的释放,从而缓解肺组织炎症。同样,胭脂素治疗也可抑制激素抵抗型哮喘小鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt和p-m TOR的蛋白表达。3.在OVA长期诱导的慢性哮喘小鼠模型中,胭脂素治疗不仅减轻气道高反应性、气道内炎症细胞聚集及炎症因子释放,而且还减少了慢性小鼠肺组织中的E-Cadherin下调,以及N-Cadherin和α-SMA的上调,缓解了气道上皮间质转化（Epithelial-to-mesenchymal transition,EMT）,从而减少气道重塑。同样,胭脂素治疗也抑制慢性哮喘小鼠肺组织中p-PI3K、p-Akt和p-m TOR的蛋白表达。结论:综上所述,我们的研究结果表明,胭脂素在体外实验以及急性、慢性和激素抵抗型哮喘小鼠模型中通过抑制PI3K/Akt通路激活表现出了抗炎、恢复部分GCs敏感性和抗EMT从而缓解气道重塑等多种药理活性,对哮喘具有保护作用。