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甘蔗花叶病毒(sugarcanemosaicvirus,SCMV)是马铃薯Y病毒属成员,在自然界中通过蚜虫和机械摩擦传播并可通过种子传代传播。该病毒是引起玉米矮花叶病的主要病原,而且能导致玉米、高梁、甘蔗和其它单子叶作物大量减产。SCMV的侵染复制是一个复杂的过程,涉及到宿主与病毒之间的防御以及反防御机制。在RNA水平调控基因表达的RNA沉默系统参与高等生物对外源遗传物质入侵的抵抗、发育分化调控和异染色质化等重要牛命活动。许多植物病毒和部分动物病毒通过编码。RNA沉默抑制因子抵御宿主的RNA沉默机制。本论文的工作主要集中在RNA沉默机制在宿主抵御SCMV侵染复制过程中所起的作用,以及SCMV如何应对这种防御系统两个方面。
通过机械摩擦的方法获得了SCMV感病的玉米株系,提取叶片RNA进行Northemblotting检测发现,感病叶片内有大量病毒基因组特异siRNA积累,这说明该病毒的侵染复制受到宿主RNA沉默机制的调控。同时在感病叶片内有大量病毒基因组RNA和外壳蛋白的存在,说明病毒通过某种机制破坏了宿主RNA沉默系统的防御。
有研究证明SCMV同属的烟草蚀纹病毒等病毒编码HC-Pro基凶抑制RNA沉默系统。在16c烟草内通过共同注射瞬时表达,本论文发现SCMV编码的HC-Pro基因可以抑制由单链RNA诱发的RNA沉默。鉴于HC-Pro是病毒编码的基因,本研究又在病毒侵染系统内检测了其RNA沉默抑制作用,利用PVX病毒侵染系统本论文发现该基因可以互补PVX编码RNA沉默抑制凶子p25的功能,抑制由病毒诱发的RNA沉默。这些结果说明HC-Pro基因是SCMV编码的RNA沉默抑制因子。
为研究HC-Pro抑制RNA沉默的具体作用方式,本论文将双链诱发载体与该基凶共注射发现HC-Pro可以抑制dsRNA诱发的RNA沉默,这说明HC-Pro基因在dsRNA形成下游具有作用位点。在上述研究中,HC-Pro基因虽然可以很好的抑制mRNA的剪切,但是却不能下调siRNA的积累。利用特殊双链诱发载体,本论文发现HC-Pro可以下调3’端secondarysiRNA的形成,抑制RNA沉默由5’向3’方向位移,深入研究发现该基因下调与RNA沉默位移相关的RDR6的积累。这些结果说明HC-Pro在RNA沉默通路中有不止一个作用位点。
利用酵母双杂交系统,研究人员从烟草中筛选出了一个和烟草蚀纹病毒HC-Pro基因相作用的内源RNA沉默抑制因子-rgs-CaM。为研究SCMVHC-Pro抑制RNA沉默作用和rgs-CaM基因的关系,本论文克隆了烟草的rgs-CaM基因和玉米内的同源基因。利用烟草脆裂病毒载体沉默烟草内的rgs-CaM基因,再在rgs-CaM沉默植株内进行瞬时表达实验发现HC-Pro仍能抑制RNA沉默。将克隆到的rgs-CaM基因和玉米内的同源基因分别与HC-Pro基因进行免疫共沉淀发现,这些基因与SCMVHC-Pro没有直接相互作用。这些结果表明rgs-CaM基因不是SCMVHC-Pro抑制RNA沉默的必需因子。
综上所述,本研究有助于阐明RNA沉默系统在宿主对抗SCMV侵染复制过程中的作用及SCMV为破坏这种防御所采用的对抗机制,并为研究HC-Pro抑制RNA沉默的具体作用方式提供了一定的依据。