G蛋白偶联受体（G-protein coupled receptor,GPCR）是一类数量庞大的膜受体家族。在人体内GPCR发挥着重要的作用。腺苷2A受体(Adenosine 2A receptor,A_2AR)是属于GPCR的A类家族成员,中枢内的大部分区域内都有A_2AR的分布,尤其是在海马和纹状体等区域中高表达。在受到脑部创伤,炎症等刺激以及神经退行性疾病中会出现A_2AR的表达增高,并引发相应行为的改变。这提示A_2AR在中枢神经系统的相关疾病中发挥重要的作用。目前干预A_2AR的方式包括使用天然或人工合成的化合物,生物大分子,基因遗传学方法或光遗传学方法等。光遗传技术在研究中枢GPCR功能方面有着高度时-空特异性的优势,通过光遗传学技术可以有效地揭示包括A_2AR在内的GPCR在神经环路的作用以及与行为之间的关系。现在已有激活型和抑制型A_2AR光遗传学工具的出现,但这些抑制型光遗传工具是基于化学合成的药物构建而成,其原理是配体和受体的结合,因此难以避免药物存在的受体选择特异性的问题。既往的研究显示A_2AR的拮抗在很多中枢相关的疾病中发挥着神经保护效应,因此对A_2AR进行有效的特异性抑制是揭示A_2AR功能的重要方式,但限于当前抑制性光遗传工具的不足难以深入研究特定环路部位的A_2AR在神经系统疾病中的作用。那么,我们是否可以不通过基于配体-受体相互作用的原理构建具有高度A_2AR特异性的光遗传工具,并运用此工具深入研究A_2AR在环路中的作用呢?冲动行为是一种在正常生理情况下会出现,但在创伤性脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）等疾病中易发的行为学改变。出现冲动行为增加的患者容易对其生活产生重大影响。杏仁核和皮质区域是与冲动行为高度相关的脑区,两个区域的相互联系在其中发挥了重要作用。TBI之后在多个脑区中有A_2AR的高表达并且已有研究表明A_2AR参与了冲动行为的调节,但目前的研究没有深入揭示脑区中的A_2AR在TBI后冲动行为产生中的作用及机制,尤其是在特定细胞类型上A_2AR的功能差异并不十分清楚。因此,在本研究中我们拟通过运用光控抑制A_2AR的工具来探究不同位置的A_2AR对冲动行为的影响,以探讨A_2AR在冲动行为发生中的作用及机制。研究中我们首先利用A_2AR的功能性抗体的部分片段合成具有拮抗A_2AR功能的肽段Anti A_2AR,通过酶联免疫反应,免疫组织化学,免疫蛋白印迹和动物行为学等方法从分子,细胞,组织和整体行为层面,证明构建的Anti A_2AR可以有效地在体内外进行表达并特异性地阻断A_2AR的下游信号。然后在Anti A_2AR的基础上通过和光敏蛋白光、氧、电压结构域相连接设计可以实现对A_2AR进行高选择性和高时-空特异性抑制的工具LOV-Anti A_2AR,并对其功能进行验证。最后,通过在杏仁核中表达LOV-Anti A_2AR并结合行为学实验揭示了A_2AR在冲动行为中的作用和机制。主要实验结果及结论:1.利用A_2AR特异性抗体Fab2838的重链结构的部分氨基酸序列构建了多个Anti A_2AR短肽表达载体。构建的短肽能在HEK293T细胞中成功表达并与共转染的A_2AR的表达位置相重合。通过用针对不同A_2AR位点的抗体免疫印迹检测该细胞发现针对A_2AR 213-230氨基酸序列的抗体无法检测到A_2AR的表达,而针对373-391氨基酸序列的抗体可以检测到部分A_2AR的表达,并且在HEK293T细胞免疫荧光染色中同样显示Anti A_2AR可以遮蔽A_2AR。在相关分子信号的检测中,多肽Anti A_2AR（29）可以有效地拮抗A_2AR对cAMP及其下游PKA,ERK和CREB的磷酸化水平的调节,并且在激动剂CGS21680存在时也可以有效阻断cAMP的升高。随着Anti A_2AR与A_2AR的比例逐渐升高Anti A_2AR对A_2AR的拮抗效应也逐渐增加,当比例达到400:1后拮抗效应不再增加。IP1和c GMP的水平不受Anti A_2AR的影响提示Anti A_2AR不影响其它G蛋白下游信号的变化。在原代培养的皮质神经元中Anti A_2AR的表达可以抑制细胞钙信号的上升。在体表达方面,纹状体中表达的Anti A_2AR与Neu N重合而不与GFAP重合,提示Anti A_2AR特异性的在纹状体的神经元中表达,并且免疫荧光染色同样显示A_2AR下游PKA和CREB的磷酸化水平降低。在纹状体中表达Anti A_2AR后小鼠在旷场和Home-cage的中心区域活动增加,在高架十字迷宫中开放臂的进入次数和停留时间增多,提示在纹状体中表达的Anti A_2AR有效地拮抗A_2AR后可以使小鼠出现焦虑缓解样表现。以上结果显示Anti A_2AR可以在细胞和动物体内特异性的发挥拮抗A_2AR的作用。2.在已构建的可以拮抗A_2AR功能的短肽Anti A_2AR的基础上,通过与LOV相连接构建了具有时-空特异性的光控拮抗A_2AR工具LOV-Anti A_2AR。通过对LOV的修饰构建了5个不同长度的LOV-Anti A_2AR。免疫荧光显示LOV-Anti A_2AR在HEK293T细胞中表达位置与A_2AR相重合。在蓝光照射下5个表达体中具有177个氨基酸长度的LOV-Anti A_2AR显示出最强的cAMP抑制效果,在使用激动剂CGS21680处理后该抑制效果同样显著。与对照组相比在无光照的情况下LOV-Anti A_2AR对cAMP的水平没有影响,提示LOV-Anti A_2AR在无光照射的条件下没有活性。不同强度蓝光刺激结果显示LOV-Anti A_2AR的拮抗效应是随光强增加而上升,随后达到饱和状态。cAMP水平在光刺激后降低,光撤除后升高的时间效应曲线提示LOV-Anti A_2AR的作用具有即时开-关的特性。LOV-Anti A_2AR的光激活对细胞中c GMP和IP1的水平无影响。免疫印迹和免疫荧光结果显示光激活LOV-Anti A_2AR可以显著降低A_2AR下游PKA,ERK和CREB的磷酸化水平。在体表达LOV-Anti A_2AR观察多通道电生理,光照激活LOV-Anti A_2AR可以降低神经元的放电频率,不影响放电的幅度。在纹状体中注射表达LOV-Anti A_2AR并用光激活,小鼠在旷场和高架十字迷宫中表现出与光照时间相符的焦虑缓解样表现。并且免疫荧光染色结果也表明LOV-Anti A_2AR在脑中是神经元特异性表达并且在光照后也能抑制PKA的磷酸化。以上结果说明构建LOV-Anti A_2AR可以在体内外有效地拮抗A_2AR的功能,并且此种拮抗作用具有较好的时-空特异性。3.通过我们自行组装的5-选择序列反应时间训练（5-CSRTT）装置建立检测冲动行为的模型,在该装置中通过对野生型的C57小鼠进行训练及测试表明该装置能够有效地检测小鼠的冲动行为。应用该装置对闭合性TBI的检测发现其完成每个阶段所需的训练次数与sham组相比有所增多,在进行测试时与sham组小鼠相比TBI小鼠的过早反应率增加。对野生型小鼠杏仁核区域注射激动剂CGS21680后过早反应率增加,而在杏仁核表达LOV-Anti A_2AR的小鼠在TBI后光照激活后过早反应率不升反而降低,提示杏仁核区域的A_2AR参与了冲动行为的发生,光控抑制杏仁核中的A_2AR可以减少冲动行为的发生。综上,我们的研究表明人工构建的Anti A_2AR是一种可以在体内和培养细胞中有效拮抗A_2AR功能的肽段;在此基础上构建的LOV-Anti A_2AR除具有特异性拮抗功能外,其光控活化还具有时-空特异性,并且具有可逆性。运用构建成功的LOV-Anti A_2AR初步证明杏仁核中的A_2AR在TBI后冲动行为中具有重要作用,为深入探索A_2AR在其中的机制奠定了基础。