目的:恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一,极大地危害人类的健康,并将成为新世纪人类的第一杀手。化疗作为肿瘤治疗的一个有效手段,在有效杀死癌细胞的同时,也产生了多重不良后果,其中之一便是骨髓抑制,主要表现为患者外周血白细胞、红细胞、血小板甚至血红蛋白的不同程度降低,严重时可以引起全血细胞悉数减少,阻碍疾病的治疗,影响患者的基本生活。本研究以五味子有效提取物五味子醇甲（JY-1）为研究对象,研究对化疗药物（环磷酰胺（CTX）、顺铂（DDP））损伤骨髓抑制的保护作用,探索JY-1对化疗所致骨髓抑制的改善作用,并以改善肠道微生态为切入点,对其抵抗骨髓抑制的可能机制进行深入探讨。方法:1.JY-1抵抗CTX、DDP所致骨髓抑制动物实验:将昆明小鼠随机分CON组,CTX&DDP组,JY1组、CTX组、DDP组、JY1（CTX）组、JY1（DDP）组,每组7只,共7组。其中JY-1组、JY1（CTX）组、JY1（DDP）组在灌胃给药60mg/kg JY-1 14天后,CTX&DDP组与JY1组腹腔注射3mg/kg DDP与60mg/kg CTX;CTX组与JY1（CTX）组腹腔注射60mg/kg CTX;DDP组、JY1（DDP）组腹腔注射3mg/kg DDP,连续三天,隔天取材,通过小鼠摄食量、体重变化情况及附睾脂肪HE染色,评估JY-1对化疗药物所致营养不良的改善作用。通过血常规、骨髓涂片、股骨HE染色、骨髓细胞凋亡、周期检测,评估JY-1对CTX&DDP、CTX、DDP所致骨髓抑制的改善作用。2.JY1体外抵抗化疗药物造成的骨髓细胞毒性实验:无菌取小鼠骨髓,悬浮于96孔板内,分别加入CTX、DDP使两种药物终浓度分别为5μmol/L、10μmol/L、50μmol/L、100μmol/L,以确定造成骨髓细胞活性抑制率最高的浓度。分别以0.1μmol/L、1μmol/L、5μmol/L的JY-1处理加入化疗药物后的骨髓细胞,通过CCK-8测定细胞活力。明确骨髓细胞活性抑制率最高的浓度及JY-1浓度后,以该浓度处理骨髓细胞,检测细胞凋亡率。3.肠道菌群移植后的造血功能及肠壁完整性检测:实验分组:将昆明小鼠随机分为CON组、CTX&DDP组、FMT-CM组、FMT-MC组、JY1组,FMT-JY1组。通过检测小鼠血常规、骨髓涂片、股骨HE染色、骨髓细胞凋亡、周期评判小鼠的造血功能。通过免疫组化检测小鼠小肠紧密连接蛋白Claudin5、免疫荧光检测ZO1表达及WB检测炎性因子IL-1β、TNF-α、iNOS蛋白的表达以评判小鼠肠道屏障的完整性。4.JY1通过肠道菌群改善化疗药物所致的免疫系统紊乱的动物实验:无菌取小鼠直肠内的粪便,于广州基迪奥公司对小鼠肠道微生物进行16srRNA测序以检测各组肠道菌群。小鼠外周血经红细胞裂解后,通过检测小鼠血细胞内CD4、CD8细胞比例以评判小鼠免疫状况。5.血清炎性因子含量的检测及血清条件培养的体外实验:通过使用ELISA试剂盒检测CON、CTX&DDP、JY1、FMT-JY1四组小鼠血清内IL-1β、TNF-α炎性因子及促红细胞生成素（EPO）含量。向骨髓细胞内加入各实验处理组（CON、CTX&DDP、JY1、FMT-JY1）的小鼠血清,检测骨髓细胞的凋亡、周期及红细胞集落形成能力。6.IL-1β、TNF-α体外处理骨髓细胞:分别以0ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、200ng/ml的IL-1β、TNF-α处理96孔板培养的骨髓细胞,加入CCK-8试剂,测定细胞活力。20ng/ml、50 ng/ml的IL-1β、TNF-α处理悬浮骨髓细胞及红细胞集落形成培养基中的骨髓细胞,悬浮细胞用于凋亡、周期检测,红细胞集落形成培养用于观察两个炎性因子对于集落形成能力的影响。7.统计分析方法:实验数据用均数±标准差表示,采用16.0 SPSS软件分析,两组间比较采用t检验,多组间比较采用单因素方差分析。^#P<0.05,^##P<0.01,^###P<0.001,^####P<0.0001,与Control组比较;^*P<0.05,^**P<0.01,^***P<0.001,^****P<0.0001,与MOD组比较;ns,P>0.05。结果:1.JY-1抵抗CTX、DDP所致营养不良及骨髓抑制:经CTX&DDP化疗处理后,小鼠出现明显的摄食量、体重减少（P<0.05）,同时附睾脂肪出现明显萎缩,而造模后给药JY-1可有效改善CTX&DDP所导致的上述营养不良状况（P<0.05）,同时对于CTX&DDP所导致的血象下降、骨髓有核细胞减少、骨髓细胞凋亡率增加及S期细胞增多骨髓抑制均有作用（P<0.05）。CTX、DDP单独用药同样会造成小鼠血象下降（P<0.05）、骨髓有核细胞减少（P<0.05）等不良反应,给药JY-1可见血象及骨髓象的恢复（P<0.05）。2.JY-1体外对化疗所致骨髓抑制的影响:CTX在体外处理骨髓细胞,并无明显的细胞毒性（P>0.05）,DDP在5μmol/L的浓度下便出现显著的骨髓细胞毒性（P<0.05）,用1μmol/L的JY-1处理提前加入10μmol/L DDP的骨髓细胞,分别检测空白对照组、DDP组、JY1组三组的骨髓细胞凋亡状况,结果表明JY1对于化疗药物所致的骨髓细胞损伤并无直接作用（P>0.05）。4.双向菌群移植对小鼠造血功能及肠壁完整性的影响:16srRNA测序结果表明,模型组与空白组相比,肠道菌群纲水平中,拟杆菌纲显著减少（P<0.05）,梭菌纲显著增多（P<0.05）,而经菌群移植后,可看到FMT-MC组菌群与模型组更为接近,FMT-CM组与空白组更为接近。通过检测外周血血常规,发现化疗小鼠的肠道菌群会对正常小鼠的白细胞、红细胞、血小板、淋巴细胞以及中性粒细胞产生影响,正常小鼠的肠道菌群虽然对白系细胞不会产生影响（P>0.05）,但改善了化疗所导致的红细胞下降（P<0.05）,骨髓涂片及股骨HE染色同样说明相同规律,可见肠道菌群对于化疗后小鼠的造血功能起着至关重要的作用。模型组的Claudin5与ZO1表达量显著降低（P<0.05）,双向菌群移植结果同样体现出相同趋势,表明通过肠道菌群不仅会对小鼠的造血功能产生影响,同样会对肠道屏障发挥作用。5.JY1通过肠道菌群改善化疗药物所致的骨髓抑制:OTU分类水平下PCOA分析、UPGMA聚类树、物种组成饼图及各水平的菌群物种堆叠图均表明化疗后小鼠肠道菌群失调,并且JY1组及FMT-JY1组有着与空白组更为接近的菌群结构,直接说明JY-1的确通过肠道菌群发挥抵抗骨髓抑制的作用。在微生物组成中,JY1组与模型组存在诸多差异菌,以厚壁菌、梭杆菌与拟杆菌最为显著,JY-1或可通过调节这几种菌群以发挥作用。通过对种水平的所有菌与白细胞、红细胞、血小板、淋巴细胞、单核细胞、中性粒细胞、CD4/CD8做了相关性分析,发现Lactobacillus＿murinus与淋巴细胞、红细胞呈显著性正相关（P<0.05）,可见或可通过提升Lactobacillus＿murinus的丰度改善造血功能。通过检测了小鼠小肠上紧密连接蛋白Claudin5与紧密连接蛋白ZO1的表达情况发现,经给药JY-1及菌群移植后,显著修复了小鼠受损的小肠屏障,并且降低了小肠炎性因子IL-1β、TNF-α、INOS的表达（P<0.05）,可见JY-1可改善因化疗导致的肠道菌群失调,并通过肠道菌群保护受损的肠道屏障。6.JY-1对血清炎性因子的影响及血清条件培养对骨髓细胞的影响:JY-1可有效减少小鼠血清IL-1β、TNF-α炎性因子含量（P<0.05）。条件培养结果表明模型组的小鼠血清会诱导体外骨髓细胞的凋亡（P<0.05）,而JY1及FMT-JY1两组小鼠血清与模型组相比,均可降低骨髓细胞凋亡率（P<0.05）,周期与红细胞集落形成结果表现出与体内实验相同的结果趋势。7.IL-1β、TNF-α对骨髓细胞的影响:IL-1β与TNF-α均会诱导骨髓细胞的凋亡（P<0.05）,但IL-1β对骨髓细胞周期无明显影响（P>0.05）,TNF-α会导致骨髓细胞S期细胞增多（P<0.05）,表现出与体内实验相同的实验结果趋势,并且抑制了骨髓红细胞集落的形成（P<0.05）。可见,除化疗本身会导致骨髓细胞凋亡,影响红系祖细胞的增殖分化,同样还可通过肠道菌群,破坏肠粘膜,释放TNF-α等有害因子入血,从而加重骨髓抑制。结论:1.JY-1具有同时抵抗顺铂、环磷酰胺及二者联合用药所导致的骨髓抑制作用。2.JY-1并非通过直接方式发挥作用,而是通过调节肠道菌群,抵抗化疗导致的小肠屏障受损及小肠炎性因子的异常表达,进而抑制炎性因子TNF-α、IL-1β释放入血,实现抵抗骨髓抑制。