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第一部分携带Mfn2基因不同结构序列的重组腺病毒的构建、扩增和纯化1.目的采用DNA重组技术,构建、制备、鉴定、扩增和纯化含线粒体融合素2基因(Mitofusin 2, Mfn2)不同结构序列的重组腺病毒。2.方法利用聚合酶链反应(Polymerase chain reaction, PCR)扩增大鼠Mfn2不同区段的互补DNA (cDNAs),将PCR产物连接到TA克隆载体(pCR8/GW/TOPO)上,筛选出含有正确片段的质粒。利用Gateway方法将含有正确片段的重组质粒与腺病毒目的质粒(pAd/CMV/V5-DEST),在LR Clonase的帮助下进行重组反应。用PacI将所得到的重组腺病毒载体切开,再利用脂质体(Lipofectamine 2000)包装后转染到293细胞中,产生重组的腺病毒。经测序鉴定无误后进行大量扩增,利用氯化铯密度梯度离心法,超高速离心纯化病毒,分装冻存于-80℃中。用紫外分光光度仪测定病毒液光密度(Optical density, OD)值,计算病毒滴度。采用Western blot方法检测目的基因在大鼠血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells, VSMCs)中的表达。3.结果8种目的基因结构序列(1A、2A、3A、4A、5A、6A、7A、8A)正确,通过PCR鉴定可检测到相应条带。8种重组腺病毒的滴度分别为27.8×109 pfu/ml、24×109 pfu/ml、19×109 pfu/ml、30.8×109 pfu/ml、6.7×109 pfu/ml、12.7×109 pfu/ml、27.6×109 pfu/ml、11.8×109 pfu/ml。Western blot检测结果显示相应的Mfn2蛋白表达。4.结论利用DNA重组技术可成功构建携带Mfn2基因不同结构序列的重组腺病毒,并通过扩增和纯化获得大量高滴度的病毒液,为进一步研究其对VSMCs增殖和凋亡的影响奠定了基础。第二部分Mfn2基因不同结构序列对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响1.目的研究大鼠线粒体融合素2基因(Mitofusin 2, Mfn2)不同结构序列对大鼠血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖和凋亡的影响,寻找能有效抑制VSMCs增殖和促进凋亡的最小cDNA (scDNA),并探讨其相关的信号通路。2.方法利用携带Mfn2基因不同结构序列的重组腺病毒感染大鼠VSMCs.采用细胞计数法、水溶性四氮唑盐(WST-8,CCK-8)法比较其对VSMCs增殖的影响；流式细胞术比较各组细胞周期的变化；流式细胞术和细胞凋亡ELISA观察各组对VSMCs凋亡的影响；Western blot法分析各组磷酸化Raf-1 (p-Raf-1)、磷酸化ERK1/2 (p-ERK1/2)、磷酸化Akt (p-Akt)蛋白表达的变化。3.结果细胞计数和CCK-8结果显示,与对照组相比,Mfn2基因不同结构序列对VSMCs的增殖均有不同程度的抑制作用(P<0.01),其中以1A、4A和8A的抑制效果最明显；流式细胞仪细胞周期检测结果表明,Mfn2基因不同结构序列较对照组均能不同程度使VSMCs生长停滞于G0/G1期(P<0.01),其中以1A、4A和8A最为明显,进入S期的细胞比例分别为(59.85±3.26)%、(34.73±2.65)%和(60.73±2.69)%；流式细胞仪Annexin V-FITC细胞凋亡检测结果表明,与对照组相比,1A、4A和8A均有明显的促VSMCs凋亡作用(P<0.01),且呈时间依赖性(48h-72h)；细胞凋亡ELISA结果显示,与对照组相比,1A、4A和8A均有显著的促VSMCs凋亡作用(P)<0.01); Western blot检测结果显示,1A、4A和8A的p-Raf-1、p-ERK1/2和p-Akt表达水平较对照组均有明显降低(P<0.01)。4.结论与Mfn2全长序列(8A, Adv-Mfn2)和去除穿膜区的Mfn2序列(4A, Adv-tMfn2)相比,Mfn2最小结构序列1A同样具有显著抑制VSMCs增殖的作用,使细胞周期停滞于G0/G1期,这一作用主要是使Ras-Raf-ERK1/2通路受到抑制,p-Raf-1和p-ERK1/2的表达下调,从而发挥抑制血管平滑肌细胞增殖的作用。此外,1A也具有促VSMCs凋亡的作用,该作用主要是通过抑制.Ras-PI3K-Akt信号通路而实现。第三部分Mfn2基因相关合成肽对血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响1.目的研究Mfn2基因相关合成肽(Mfn2 gene-related synthetic peptide, MRSP)对大鼠血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cells, VSMCs)增殖和凋亡的影响,并探讨其相关的信号通路。2.方法在Mfn2最小功能序列1A的C端加上TAT穿膜多肽,人工合成MRSP。采用细胞计数法、水溶性四氮唑盐(WST-8, CCK-8)法观察不同浓度的MRSP(1μM、10μM、25μM、50μM、100μM)对VSMCs增殖的影响；流式细胞术比较不同浓度MRSP对VSMCs细胞周期的影响；细胞凋亡ELISA和流式细胞术观察MRSP对VSMCs凋亡的影响；Western blot法分析各组磷酸化Raf-1 (p-Raf-1)、磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)、磷酸化Akt (p-Akt)蛋白表达的变化。3.结果人工合成MRSP为白色冻干粉末,纯度97.2%,分子量3305,水溶性良好(PBS中的溶解度为1mg/ml)。细胞计数和CCK-8结果均显示,与对照组相比,MRSP在10μM～100μM范围内可成剂量和时间依赖性的抑制VSMCs的增殖(P<0.01)。流式细胞仪细胞周期检测结果表明,不同浓度的MRSP (10μM、25μM.50μM)较对照组均能使VSMCs生长停滞于G0/G1期(P<0.01),G0/G1期的细胞比例分别为(24.90±3.46)%、(36.85±3.57)%和(62.45±2.83)%；流式细胞仪Annexin V-FITC细胞凋亡检测结果表明,与对照组相比,随着时间的延长(24h、48h、72h),25μM MRSP可有效诱导VSMCs的凋亡,作用72h时的细胞凋亡率为(30.4±2.1)%(P<0.01)；细胞凋亡ELISA结果表明,随着时间的延长,25μM MRSP与对照组相比有显著的促VSMCs凋亡作用(P<0.01)；Western blot检测结果显示,与对照组相比,MRSP可成浓度依赖性(10μM、25μM、50μM)的抑制p-Raf-1、p-ERK1/2和p-Akt的表达水平(P<0.01)。4.结论根据Mfn2的最小功能序列人工合成的MRSP具有显著抑制VSMCs增殖的作用,使细胞周期停滞于G0/G1期,这一作用主要是使Ras-Raf-ERK1/2通路受到抑制,p-Raf-1和p-ERK1/2的表达下调,从而发挥抑制血管平滑肌细胞增殖的作用。此外,MRSP也具有促VSMCs凋亡的作用,该作用主要是通过抑制]Ras-PI3K-Akt信号通路而实现。