喉癌是头颈部常见的恶性肿瘤，95％以上喉癌为喉鳞癌，其发病率约占全身恶性肿瘤的2％，占耳鼻咽喉癌的11％～22％。由于环境致癌因素的增加，喉癌的发病率呈不断增长趋势。虽然肿瘤诊断与治疗的手段日新月异，但全球的喉癌总体生存率在近二十年内并未得到改善。自1987年首先报道raf癌基因与喉癌有关以来，至今报道有五十余个癌基因与喉癌有关，但一直没找到令人满意的特异性的治疗靶点。 DJ-1基因是于1997年在研究NIH-3T3细胞的H-ras基因中发现的一种对Ras基因具有协同作用的癌基因。近年来的研究发现，DJ-1基因与恶性肿瘤的密切相关。DJ-1在肿瘤细胞中具有促进肿瘤细胞生长、促进肿瘤细胞迁移的作用。DJ-1基因在喉癌中作用尚未见报道。因此，开展DJ-1基因在喉癌中的研究，将有可能为喉癌的治疗寻找出一种新的途径。 目的 采用免疫组织化学方法检测喉鳞状细胞癌中DJ-1蛋白表达，分析DJ-1蛋白表达水平与喉鳞状细胞癌临床病理特征的关系；应用RNA干扰(RNAinterferce，RNAi)技术抑制Hep-2细胞的DJ-1基因表达，检测针对人DJ-1基因的特异性小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)对Hep-2细胞效应。 方法 一、喉癌中DJ-1的表达与意义：研究标本来源于中山大学第一附属医院耳鼻咽喉科医院1995年1月～2006年12月期间住院接收手术治疗的喉鳞癌患者，包括喉鳞状细胞癌术后新鲜癌组织标本15例(并取癌旁组织、正常喉黏膜组织各1 5例作为对照，标本编号保存在-75℃低温冰箱备用)和术后癌组织石蜡标本71例(并取非喉癌的喉粘膜组织9例作为对照)，术前均未进行化学治疗和放射治疗。 1.15例喉鳞状细胞癌术后组织冰冻标本的DJ-1蛋白表达采用间接免疫荧光方法检测(并取癌旁组织、正常喉黏膜组织各15例作为对照)。 2.7 1例喉鳞状细胞癌患者术后癌组织和9例非喉癌者喉粘膜组织的石蜡标本中DJ-1蛋白表达应用免疫组织化学链霉菌抗牛物素蛋白．过氧化物酶连结法(Streptavidin Peroxidase，SP)法检测，分析其DJ-1蛋白表达水平与临床病理特征的关系。 二、RNA干扰DJ-1基因抑制Hep-2细胞增殖：设计合成3对特异性针对人DJ-1基因的小干扰RNA(siRNA)，脂质体法转染Hep-2细胞，实验分为4组：瞬时转染非特异性siRNA对照组及转染特异性siRNA 3组(siRNA Ⅰ、siRNAⅡ、siRNA Ⅲ)。采用RT-PCR检测DJ-1 mRNA，蛋白免疫印迹法检测DJ-1蛋白，流式细胞仪检测细胞凋亡及MTT比色法检测特异性siRNA 1组对Hep-2细胞效应。 结果 1.15例喉鳞状细胞癌组织、癌旁组织、正常黏膜组织的冰冻标本中DJ-1蛋白表达水平采用间接免疫荧光方法进行检测，结果显示DJ-1蛋白在喉鳞状细胞癌组织的表达水平分别高于癌旁组织和正常黏膜组织(P<0.01，P<0.01)，而癌旁组织的DJ-1蛋白表达与正常粘膜组织表达差异无统计学意义；喉鳞状细胞癌的临床分期、年龄分别与DJ-1蛋白的表达均无相关性；低分化喉鳞癌较高分化喉鳞癌的DJ-1蛋白水平增高(P<0.01)。 2.71例喉鳞癌的石蜡标本中DJ-1蛋白表达水平应用免疫组织化学SP法检测，结果显示：(1)喉鳞状细胞癌组织中DJ-1蛋白阳性表达率为85.9％(61／71)，与非喉癌的喉粘膜组织55.5％(5／9)比较，喉鳞状细胞癌DJ-1蛋白表达阳性率增高，差异有统计学意义(P<0.05)。 (2)喉鳞状细胞癌组织中DJ-1蛋白表达水平与患者性别、年龄、原发部位、T分型、临床分期、淋巴结转移和癌肿病理学分级均无相关性；DJ-1蛋白高表达的患者复发率(53.3％)较DJ-1蛋白低表达者的复发率(26.8％)增高(P<0.05)。 (3)Kaplan—Meier法和long—rank检验发现喉鳞癌患者的癌肿原发部位、性别、年龄、T分型、临床分期和癌肿病理学分级对术后累积生存率影响均无统计学意义；DJ-1蛋白表达水平和淋巴结转移对术后累积生存率影响均有统计学意义(．P<0.05，P<0.05)， DJ—1蛋白低表达患者其5年累积牛存率要高于DJ-1蛋白高表达患者(P<0.05)，两者的5年生存率分别为71.6％和38.2％。 3.本实验设计合成的3对特异性siRNA均有不同程度地抑制DJ-1基因表达，其中特异性siRNA 1组抑制效果最佳。MTT比色法结果显示特异性siRNA I组(终浓度50 nmol／L、100 nmoi／L)对Hep-12细胞增殖具有抑制作用。流式细胞仪检测结果显示特异性siRNA I组能诱导Hep-2细胞凋亡：转染siRNA I组平均凋亡率为15.7％，转染非特异性sirNA对照组平均凋亡率为4.5％，空白对照组为3.5％，单因素方差分析结果显示，3组均数不完全相同(F=16.405，P<0.01)。进一步采用LSD-t检验做组问两两比较，结果显示，转染siRNA I组与后两对照组比较差异有统计学意义(P<0.01，P<0.01)，转染非特异性siRNA对照组与空白对照组比较差异无统计学意义。 结论 1.DJ-1蛋白在喉鳞状细胞癌组织的表达水平分别高于癌旁组织和喉黏膜组织。喉鳞癌组织中DJ-1蛋白表达水平高低对患者术后复发和预后一定临床指导价值：其表达越强，患者的生存时间越短、复发率越高。 2.转染特异性人DJ-1基因的siRNA能有效抑制DJ-1基因表达，抑制Hep-2细胞增殖和诱导Hep-2细胞凋亡，建立了有效抑制DJ-1基因表达的RNA干扰方法。