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基因组高度保守地在世代间传递是真核生物物种得以延续的物质基础。在真核细胞中,遗传物质经过精确地复制后,均等地分配到两个子代细胞中,使每个子代细胞都得到与亲代细胞相同的遗传物质。在这一遗传物质的传递过程中,DNA的复制与姐妹染色单体的分离是两个关键的步骤。
DNA的复制调控关键在于前DNA复制复合体(pre-Replication Complex,pre-RC)的组装,即Orcs、Cdc6、Cdt1、Mcms顺序性募集到复制起始点。细胞通过CDK和Geminin在细胞周期中的活性变化来调节pre-RC的组装。
本文研究结果显示在整个细胞周期中Cdc6均存在,并且有相当部分Cdc6滞留在细胞核中,与染色质相结合。不仅ATP的存在影响Cdc6与染色质的结合,其C末端近1/3的长度(418aa-554aa)对于其和染色质的结合也是必需的。除了结合到染色质上,有部分Cdc6在G1期定位到核仁中。ATP的结合和NLS的存在对于Cdc6的核仁定位也是必需的。
本文结果还显示,在pre-RC组装过程中,CDK与Geminin的功能密切相关。Geminin通过CDK的磷酸化调节,在DNA复制的起始调控中起着双重作用。间期,Geminin和Cdt1以非磷酸化形式存在,Cdt1与染色质结合,Geminin与Cdt1的结合可以阻止Mcm的募集,防止在DNA复制后新的pre-RC形成,起负调控作用;M期,Geminin和Cdt1被M期CDK磷酸化后,均不能与染色质结合;抑制M期CDK活性,体内激酶与磷酸酶的作用失去平衡,逐渐失去磷酸基团的Cdt1与Geminin又重新与染色质结合。M期Geminin以磷酸化状态结合磷酸化的Cdt1,保护Cdt1免受降解,维持下一个pre-RC组装时Cdtl的特定浓度,对pre.RC的形成起促进作用。M期晚期,Geminin经由泛素化途径降解。Geminin的降解,可能使与之结合的Cdt1释放,用于启动下一个细胞周期pre-RC的装配。说明CDK通过磷酸化Geminin调节Cdt1的功能。
基因组稳定性的维持需要完整基因组的精确复制及随后染色体忠实地分离到两个子细胞中。中心体是参与有丝分裂期纺锤体组装与姐妹染色单体分离的重要细胞器。如果没有中心体,动物体细胞就会阻滞在G1期,不能开始DNA复制。如果中心体过量复制或是不能有效分离,会导致多极或单极纺锤体的形成,造成遗传物质的异常分离,这与癌症的形成密切相关。在肿瘤细胞U2OS和HCT116以及原代细胞TIG3中,通过RNA干扰技术去除Geminin,不仅引起基因组过度复制,还导致中心体过度复制。暗示Geminin对中心体复制的调控在人类正常细胞和肿瘤细胞中均存在。但是Geminin丢失引起中心体过度复制的机制尚不清楚,并且与Geminin有直接相互作用且定位在中心体的蛋白尚未发现。
本研究发现,有部分Geminin定位在中心体上。Geminin的coiled-coil结构域对于Geminin定位到中心体上是必需的。过表达GFP-p50能够减弱Geminin在中心体上的定位,而降低细胞内ATP水平则增加Geminin在中心体上的聚集。过表达p50能够抑制dynein/dynactin的活性,ARP1是dynein/dynactin复合体中含量最多的一个成分,它在dynein/dynactin复合体与被运送到中心体的货物之间起着桥梁的作用。本研究发现,Geminin与ARP1直接相互作用,并且在中心体上共定位。过表达GFP-p50可以削弱二者在中心体上的聚集。说明Geminin通过ARP1介导由dynein/dynactin运送到中心体上。
本文认为,Geminin可能通过在不同细胞时期中的定位变化以及磷酸化程度的改变影响Cdt1的作用,以完成对DNA复制的调控。此外,Geminin通过微丝相关蛋白1(actin-related protein,ARP1)介导定位于中心体上,并参与中心体的复制调控过程。本研究为深入探讨DNA复制与中心体复制两大事件的协同机制提供了重要线索。