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灵芝是具有极高药用价值的药食两用菌,临床上广泛用于肿瘤和肝病的预防及治疗中,一般认为其活性因子是多糖和三萜类化合物,对于灵芝中肽类化合物的研究一直鲜见报道,本文以灵芝菌丝粉中的灵芝内源肽(GLP)为研究对象,采用膜分离技术和RP-HPLC、毛细管电泳、HPLC-ESI-MS/MS等现代分析手段,并结合现代生物技术,首次系统地研究了灵芝内源肽的结构、对肝病的干预及其机理、构效关系,主要结果如下：1.灵芝肽的分离与纯化以提取物对羟基自由基的清除活性为跟踪指标,比较了灵芝菌丝粉水提物及其各组分的活性,对灵芝肽的提取条件进行了优化,结果显示灵芝多糖对羟基自由基的清除能力远不如小分子肽强,灵芝水溶性小肽是·OH的强力清除剂,Cu2+-SephadaxG-25配位色谱法能有效地将灵芝中的小肽与氨基酸分离,分离所得混合肽GLP的纯度达91.53%,得率为9.66%。GLP再分别经RP-HPLC和毛细管电泳分离,分别得到8个色谱峰和13个峰,初步推断均为肽峰。2.灵芝肽的抗氧化活性与机理由于抗氧化是护肝的重要机制之一,故本文采用了在脂质体系、非脂质体系及动物体外实验中的多种评价抗氧化能力的方法,首次对GLP的抗氧化活性进行了系统地研究,结果显示GLP无论是在脂质体系、非脂质体系还是在动物体外实验中均表现出良好的抗氧化活性,其抗氧化机理涉及：(1)清除自由基；(2)抑制卵磷脂氧化：保护生物膜结构与功能的完整性；(3)较强的还原能力,可还原氧化物和氧化产物,保护谷胱甘肽和巯基不被氧化；(4)螯合非血红素铁和其它促进脂质氧化的金属离子,抑制脂肪氧合酶的活力,抑制脂质过氧化；(5)不同肽之间的协同增效效应。3.灵芝肽的护肝活性与机理选用了四种常用的肝损伤模型,通过测定与各模型的作用机制相应的生化指标,并进行了肝组织病理学检查,首次较系统地探讨了灵芝肽的护肝活性及机理。结果显示GLP对CCl4、D-Gal、酒精、BCG+LPS诱导的四种急性肝损伤模型均有良好的保护作用,尤其是当GLP灌胃剂量为180 mg/kg-bw时,各种生化指标和病理学变化与正常组接近；提示灵芝的保肝活性因子除多糖、三萜类化合物外,还有灵芝肽。其护肝机理涉及(1)良好的抗氧化活性：清除活性氧自由基的能力、还原性和抗磷脂氧化；(2)正向免疫调节作用；(3)良好的氨基酸构成。4.灵芝肽诱导人肝癌HepG2细胞凋亡的研究在上述工作的基础上,首次考察了GLP对肝脏损害更大的肿瘤细胞——人肝癌HepG2细胞的抑制作用,结果显示GLP在体外可抑制人肝癌HepG2细胞的增殖,且存在量效关系和时效关系；GLP可使HepG2细胞阻滞于G0/G1期并诱导其凋亡,灵芝肽的浓度与细胞凋亡率之间存在一定的剂量依赖性。其诱导HepG2细胞凋亡的机制是GLP使细胞内Ca2+超载,导致细胞凋亡；并下调Bcl-2和survivin基因表达,上调p53基因表达及激活Caspase-3活性。5.灵芝中肽与多糖、三萜类化合物抗氧化、保肝活性比较对灵芝中肽、多糖(GLPS)、三萜类化合物(GLT)单组分及其组合组的抗氧化、保肝活性进行了比较,结果显示在体外试验中,当12.5mg/mL的GLPS与3.75mg/mL的GLP组合时,无论有无自由基诱导剂存在,其对小鼠肝组织中MDA生成的抑制均呈现出了协同增效效果。在D-Gal肝损伤模型实验中,GLP(150mg/kg-bw)、GLPS (800mg/kg-bw、GLT(100mg/kg-bw)及三者组合,均能极显著降低小鼠血清中ALT、AST活性(P<0.01),极显著地抑制肝组织中SOD/GPX活性、GSH含量的下降及MDA含量的升高(P<0.01)；但生化指标除GSH外,三者组合组均未显示出明显的增效作用；而肝组织病理学照片却显示三者组合组小鼠肝细胞病变明显好转或恢复,效果好于单组分组。灵芝肽的抗氧化活性、保肝活性均优于灵芝多糖,但保肝活性不及灵芝三萜类化合物。6.灵芝肽的一级结构及构效关系采用HPLC-ESI-MS/MS方法对GLP进行了在线分离和鉴定,对三个寡肽的一级结构进行了解析,结果显示：m/z分别为365.1、566.8和814.5准分子离子的氨基酸序列分别是：Ser-Asp-Gly-Ser的四肽、Ala-His-Leu(Ile)-Leu(Ile)-Leu(Ile)五肽和Leu(Ile)-Leu(Ile)-Leu(Ile)-Thr-Phe-His-Ala七肽。该四肽的组成氨基酸均具有抗氧化作用；该五肽和七肽均是高F值寡肽。