研究背景心肌梗死是全球范围内广泛关注公共卫生问题。是发展中国家最大的死亡原因之一。随着临床治疗手段和新药研发不断进步，在过去30年中，心肌梗死所导致的直接死亡率（发生心肌梗死后30日内）降至10%，但其一年内的死亡率高居50%。与其他脏器的细胞不同，传统意义上，心肌细胞被认为是终末细胞，发生梗死后心脏难以再生心肌细胞来修复受损组织。因此保护心肌细胞，缩小梗死面积，就成为保护心功能的关键。大量研究表明，心肌缺血后急剧升高的活性氧簇（包括如超氧阴离子和过氧化氢）可导致氧化应激，后者在心肌缺血损伤中可加重细胞损伤，是导致心肌细胞坏死增多、梗死面积增大最重要的原因之一。在急性心肌梗死和不稳定型心绞痛患者的早期均检测到过量活性氧簇的生成。急性期细胞保护不完善，导致细胞坏死增加，可能是目前心脏保护性治疗效果受限的原因之一。在缺血损伤早期，超氧化物歧化酶类可通过失活超氧阴离子、阻止一氧化氮减少、阻断超氧阴离子生成更具有破坏性的活性氧簇（如过氧亚硝酸盐和其活性产物）对心肌细胞起良好的保护作用。进一步对铜/锌超氧化物歧化酶的分布动力学检测后发现：细胞间质的铜/锌超氧化物歧化酶（即超氧化物歧化酶3/细胞外超氧化物歧化酶）对缺血/再灌注损伤的心肌起主要保护作用。细胞外超氧化物歧化酶是目前所知唯一的由细胞分泌的超氧化物歧化酶的亚型，其通过粘附到细胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖来发挥保护性作用。细胞外超氧化物歧化酶是细胞外基质唯一的清除活性氧簇的酶，主要存在于大多数组织的细胞外基质中。目前研究表明：心肌梗死后，使用cDNA编码膜粘附的人细胞外超氧化物歧化酶基因治疗可明显改善梗死后心功能、减小梗死面积。并且，细胞外超氧化物歧化酶不仅可逆转心肌顿抑后收缩功能减低，也可改善心肌缺血/再灌注后所造成的损伤。在急性心肌梗死和不稳定型心绞痛患者的早期阶段，心肌损伤面积和体内细胞外超氧化物歧化酶的含量呈反比。但是，这些通过直接使用细胞外超氧化物歧化酶质粒或通过病毒转染的传统方法受限于病毒基因治疗的安全性和全身性用药的有效性，从而使细胞外超氧化物歧化酶向临床应用的转化面临困难：例如使用病毒作为载体转染ecSOD，在损伤局部表达效率低，稳定性差，易受机体免疫系统识别后吞噬清除，从而减低目的基因的表达效能；此外，细胞外超氧化物歧化酶的分泌受转染的宿主细胞状态的影响，直接给于细胞外超氧化物歧化酶质粒或由病毒包装后的载体到靶组织，很难控制受转染的宿主细胞的状态从而取得理想的细胞外超氧化物歧化酶分泌量。K. Karlsson等研究指出，在兔静脉直接使用细胞外超氧化物歧化酶基因后，其在血管内的半衰期仅仅15个小时。骨髓间充质干细胞是一种具有多向分化潜能的成体干细胞，由于其独特的优势使其可成为以成体干细胞为基础的基因治疗的载体。骨髓间充质干细胞易于自患者或供着骨髓中分离，体外扩增方法简单，可用于进行高效的基因工程设计。大量研究表明，干细胞可有效阻止局部免疫反应，并且其免疫豁免性使其作为载体携带目的基因至靶组织后，可避免目的基因被自身免疫系统识别、捕获后清除。从而增加目的基因在局部的表达效率；并且，干细胞可受到局部凋亡、炎性因子等信号的趋化作用，主动将目的基因带入损伤局部。研究指出：经细胞外超氧化物歧化酶基因修饰的骨髓间充质干细胞（即BMSCs-ecSOD）可以明显减少受辐射后小鼠的死亡率。骨髓间充质干细胞可作为基于细胞的基因治疗方式的绝佳载体。据此，本研究提出这一假设：经细胞外超氧化物歧化酶基因修饰的骨髓间充质干细胞可以获得更好的心脏保护作用。研究目的1、明确超氧化物歧化酶基因修饰的骨髓间充质干细胞对心肌梗死后心功能存在保护作用；2、观察超氧化物歧化酶基因修饰的骨髓间充质干细胞对离体心肌细胞的保护作用；3、研究超氧化物歧化酶基因修饰的骨髓间充质干细胞对心肌细胞保护作用的机制。研究方法采用8-10周龄体重22-28g，β-Actin-luc健康雌性转基因小鼠行骨髓间充质干细胞分离培养后，以构建的人细胞外超氧化物歧化酶病毒进行细胞转染，采用Elisa法检测经转染后骨髓间充质干细胞分泌细胞外超氧化物歧化酶的量，确立最适感染复数。将雌性FVB小鼠分为四组：假手术组（只开胸不结扎冠脉）以及心肌梗死半小时分别局部心肌注射PBS/BMSCs/BMSCs+ecSOD。术后48小时后通过TUNEL和Caspase-3检测细胞凋亡率。术后1，3，5，7，14，21，28天采用小动物超声和生物活体成像检测心功能和移植后细胞存活变化。以Western Blot检测各组心肌局部细胞外超氧化物歧化酶的表达。光泽精增强化学发光法检测局部组织活性氧的含量。细胞水平将分离培养的心肌细胞通过Transwell，与经细胞外超氧化物歧化酶修饰间充质干细胞的建立共培养体系，模拟缺血再灌注模型，经TUNEL和Caspase-3检测心肌细胞凋亡率。以Western Blot检测Akt，Erk1/2, FoxO3a细胞水平的变化。研究结果1.超氧化物歧化酶基因修饰的骨髓间充质干细胞可显著改善心肌梗死后心功能1.1由ecSOD转染的BMSCs分泌的ecSOD呈浓度依赖的方式BMSCs转染ecSOD病毒载体后24，48及72小时，MOI＜300时，由BMSCs-ecSOD分泌的ecSOD的生物活性呈剂量依赖性，反之，但MOI＞300时，ecSOD的分泌活性并没有相应增加。并且，当MOI=300时，ecSOD的分泌活性在48h时达到高峰。因此，选用MOI=300继续后续实验。1.2心肌梗死后移植的BMSCs-ecSOD组细胞存活量明显增多与BMSCs组比较，BMSCs-ecSOD组细胞存活量明显增加，两者比较,移植后7天时p <0.05,21天时p <0.001。1.3移植BMSCs-ecSOD可明显保护心功能，显著减少梗死面积与MI及BMSCs组相比，BMSCs-ecSOD组在术后3天时LVEF明显改善，这种现象在术后7天达到峰值，并持续至术后至少28天。术后28天行马松三色染色结果显示与心脏超声结果一致。1.4移植的BMSCs-ecSOD持续提高损伤心肌局部ecSOD含量，同时伴随局部ROS的减少与其他三组比较，BMSCs-ecSOD组明显增加组织水平ecSOD的表达活性，同时伴有ROS活性降低。尽管BMSCs-ecSOD组分泌ecSOD的生物活性随时间而减少，但至少超过10天。1.5BMSCs-ecSOD在损伤心肌组织局部具有明显的抗凋亡作用组织水平观察，与其他三组比较，BMSCs-ecSOD组有显著抗心肌细胞凋亡的能力。2.超氧化物歧化酶基因修饰的骨髓间充质干细胞可减少离体心肌细胞的凋亡，同时降低ROS的浓度。2.1与BMSCs-ecSOD共培养可显著减少缺氧加无血清刺激后心肌细胞凋亡率细胞水平显示与BMSCs-ecSOD共培养的心肌细胞凋亡明显减轻。2.2ecSOD可降低心肌细胞缺氧诱导的O2-的产生与未经共培养的心肌细胞比较，经过与BMSCs-ecSOD共培养的心肌细胞原位O2-产生减低。3．超氧化物歧化酶基因修饰的骨髓间充质干细胞可提高细胞水平Akt，Erk1/2磷酸化的程度ecSOD的表达增加可分别提高Akt，Erk1/2以及FoxO3a磷酸化的水平。提示ecSOD对心肌的保护作用至少部分是通过该途径完成的。研究结论1.本研究首次采用新型的以细胞为基础的基因治疗方式：使用BMSCs作为载体传递ecSOD基因，在体研究证明其可明显改善梗死后心脏的心功能；2.本实验发现心肌梗死后局部心肌移植经ecSOD基因修饰的BMSCs，细胞活性增加，局部存活延长。同时ecSOD在局部组织表达时间延长；3.体内、外实验结果均显示，ecSOD的表达可显著减少心肌细胞的凋亡；4. ecSOD的心肌细胞的保护作用可通过上调Akt，Erk1/2以及FoxO3a信号通路实现；5.这种以细胞为基础的基因治疗方式可能会成为损伤心肌保护的新方法。