粘细菌新菌株的筛选鉴定及其生物活性研究

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粘细菌(myxobacteria)是土壤中较为常见的一类单细胞革兰氏阴性细菌,营养细胞杆状,具有复杂的多细胞行为,可以滑行运动,能产生结构各异、种类多样、活性高效的次级代谢产物,在农业、医药、生态环境等方面具有重要的研究应用价值,已经成为越来越多研究工作者的研究热点。本研究采用了灭活大肠杆菌和滤纸片诱导子实体法分离粘细菌,通过形态学观察、生理生化实验以及16SrRNA基因序列同源性分析,对分离得到的粘细菌进行鉴定并归类。共分离得到8株粘细菌(S84、S85、S86、S87、S88、S89、S90、S91),其中堆囊菌(Sorangium)5株,多囊菌(Polyangium)1株,粘球菌(Myxococcus)1株,侏囊菌(Nannocystis)1株。经16S rRNA序列同源性分析可知,S84、S85、S86、S89 与 Sorangium cellμLosum strain KYC3047 具最高相似性,相似性均为 99%,S87与Sorangium cellμLosum strain DSM14731 具最高相似性,相似性为 99%,S88 与 Polyangium cellμLosum strain So02007-3具最高相似性,相似性为99%,S90与Myxococcus sp.XAC03具最高相似性,相似性为99%,S91与Nannocystispusilla strainNap29具最高相似性,相似性为99%。将这8株菌分别鉴定并命名为 S84(S.cellμLosum STXZ84),S85(ScellμLosum STXZ85),S86(S.cellμLosum STXZ86),S87(S.cellμLosum STXZ87),S88(P.cellμLosum STXZ88),S89(S.cellμLosum STXZ89),S90(Myxococcus sp.STXZ90),S91(N.pusilla STXZ91)。通过体外抗肿瘤实验发现,8株粘细菌对小鼠黑色素肿瘤细胞(B16)、人肝癌细胞(SMMC-7721)、小鼠乳腺癌细胞(4T1)、人类宫颈癌细胞(HeLa)、人类肝癌细胞(Hep-3B)等多种肿瘤细胞和人正常细胞脐静脉上皮细胞(HUVEC)显示了不同程度的细胞增殖抑制作用。随后根据粘细菌活性实验检测结果,我们选定了 S90进行进一步的抗肿瘤活性实验、分离纯化及抑菌实验。将S90的发酵上清经XAD-16吸附,甲醇洗脱后的粗提物进行多种细胞毒性检测实验,发现其对 Hep-3B、Hela、SMMC-7721、B16、4T1、SW480、HUVEC的最低半抑制浓度(IC50)分别为:0.328 μg/mL、0.454 μg/mL、0.279μg/mL、0.453 μg/mL、0.633 μg/mL、0.926 μg/mL、1.228 μg/mL。对该甲醇洗脱物进行RP-HPLC分离,得到1个较纯的单峰物质,LC-MS/MS鉴定结果显示该物质分子量大小为183.07 Da,体外肿瘤细胞实验结果显示该组分具较强的抗肿瘤活性,具有重要的开发价值。通过平板对峙培养法(Plate Confrontation CμLture Method)发现,S90能抑制多种人类致病菌,如产气肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、普通变形杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌及鱼类致病菌,如嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌、豚鼠气单胞菌、迟缓爱德华氏菌等,有开发抗菌药物的潜能。本研究工作发现的具有抗菌和抗肿瘤活性的粘细菌新菌株不仅丰富了微生物药用菌种资源库,对菌株S90抗肿瘤细胞活性物质的分离工作也为药物先导分子的的研发及应用奠定了重要基础。
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