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目的探讨白花丹素（Plumbagin,PLM）对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（EGFR tyrosine kinase inhibitors,EGFR-TKI）吉非替尼（Gefitinib）原发性耐药与获得性耐药的肺腺癌（lung adenocarcinoma,LUAD）细胞的抗肿瘤作用及机制。方法1.在LUAD细胞HCC827上通过浓度梯度递增法建立吉非替尼获得性耐药细胞株HCC827 GR。MTT实验检测吉非替尼给药72 h或PLM处理48h后,正常肺上皮细胞BEAS-2B、吉非替尼敏感细胞HCC827、吉非替尼原发性耐药细胞A549、吉非替尼获得性耐药细胞HCC827 GR和H1975的IC50值,并根据耐药指数（Resistance Index,RI）=耐药株IC50/亲本株IC50计算RI。通过平板克隆实验观察PLM对吉非替尼原发性耐药细胞A549、吉非替尼获得性耐药细胞HCC827 GR和H1975细胞克隆形成能力的影响。通过HE染色观察细胞形态、Hoechst染色观察细胞核、透射电镜观察细胞亚显微结构和流式细胞术测凋亡率以及Western Blot检测凋亡相关蛋白表达变化,观察PLM的抗肿瘤特性。2.收集13例LUAD患者手术切除癌组织及癌旁组织进行m RNA测序（m RNA sequencing,RNA-Seq）,探索缝隙连接蛋白26（Connexin26,Cx26）的差异表达情况,并通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,q RT-PCR）在5例配对临床标本进行验证。然后利用肿瘤数据库探索Cx26在LUAD组织和细胞的转录水平及与预后的关系,通过GO（Gene Ontology）注释和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路分析探索Cx26主要的生物功能和主要参与的通路。通过q RT-PCR、Western Blot和免疫荧光（Immunofluorescence,IF）检测Cx26在吉非替尼耐药LUAD细胞表达和分布情况,通过划痕染料标记示踪法（scrapeloading and dye transfer,SL/DT）检测细胞间缝隙连接通讯（gap junctional intercellular communication,GJIC）。3.通过Western Blot检测PLM处理48 h对吉非替尼原发性耐药细胞A549、吉非替尼获得性耐药细胞HCC827 GR和H1975细胞中Cx26表达的影响。通过流式细胞术检测Cx26表达增强剂丙戊酸（valproic acid,VPA）和干扰Cx26对PLM诱导的HCC827 GR细胞凋亡率的影响。通过免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation,Co-IP）实验检测PLM对Cx26与Bax在吉非替尼耐药LUAD细胞中相互作用的影响。结果1.HCC827 GR细胞的RI=139.38,我们成功构建吉非替尼获得性耐药株HCC827 GR。吉非替尼给药后,吉非替尼原发性耐药细胞A549和替尼获得性耐药细胞H1975的IC50值显著大于吉非替尼敏感细胞HCC827（均P＜0.001）。PLM对BEAS-2B细胞有较大毒性,对吉非替尼原发性耐药细胞A549、替尼获得性耐药细胞HCC827 GR和H1975均具有抗肿瘤活性。其中,HCC827 GR和H1975的IC50值显著小于A549（均P＜0.001）。PLM可浓度依赖性下调吉非替尼耐药LUAD细胞的克隆形成率（均P＜0.05）。2.HE染色显示PLM或顺铂给药后吉非替尼原发性耐药细胞A549、吉非替尼获得性耐药细胞HCC827 GR和H1975出现细胞质减少、细胞核边集等凋亡细胞形态变化。Hoechst染色显示PLM处理后A549、HCC827 GR和H1975细胞出现染色质固缩、细胞核致密浓染,并可观察到核破碎、“半月形”核和凋亡小体,与阳性对照药顺铂诱导的凋亡现象一致。透射电镜观察到PLM处理后A549、HCC827 GR和H1975细胞胞质均出现空泡,可见染色质破碎、浓缩且外周化,观察到线粒体剧烈肿胀、内部空泡化、线粒体脊结构发生溶解和凋亡小体。流式细胞术结果显示,随着PLM处理浓度的增大吉非替尼原发性耐药细胞A549、吉非替尼获得性耐药细胞HCC827 GR和H1975细胞的凋亡率上升（P＜0.001）,而凋亡抑制剂Z-VAD可拮抗PLM诱导的凋亡（P＜0.001）。Western Blot结果显示,PLM处理后吉非替尼获得性耐药细胞剪切型Casepase3和剪切型PARP表达增加（P＜0.05）,Bax/Bcl-2比值增大（P＜0.01）。3.RNA-Seq共鉴定出3278个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs）,其中在LUAD组织较正常肺组织差异表达上调倍数最高的Cx家族成员是Cx26,约为正常肺组织的38.59倍（P＜0.001）。q RT-PCR结果显示Cx26在4/5例配对LUAD组织较癌旁组织高表达,其平均差异倍数为10.80±13.70倍（P＜0.05）。肿瘤数据库验证结果显示,Cx26在LUAD癌组织较正常肺组织上调（P＜0.001）,且Cx26高表达与LUAD患者不良预后有关（P＜0.01）。GO和KEGG分析显示Cx26参与了细胞对药物的反应、通道活性以及吞噬、炎症和凋亡等生物过程。4.qRT-PCR和Western Blot结果显示,Cx26在吉非替尼原发性耐药细胞A549、吉非替尼获得性耐药细胞HCC827 GR和H1975细胞的m RNA和蛋白水平较BEAS-2B细胞高（P＜0.05）。IF结果显示,Cx26在A549、和HCC827 GR细胞主要分布在细胞质中,在H1975细胞主要分布在细胞核中,少量分布在细胞膜上。SL/DT实验结果显示,阳性对照细胞CAFs存在黄色荧光染料传递,而吉非替尼原发性耐药细胞A549、吉非替尼获得性耐药细胞HCC827 GR和H1975细胞中均未发现明显的染料传递。5.Western Blot结果显示,PLM处理后吉非替尼原发性耐药细胞A549、吉非替尼获得性耐药细胞HCC827 GR和H1975细胞中Cx26表达水平降低（均P＜0.05）,流式细胞术结果显示VPA可拮抗PLM诱导的HCC827 GRNC细胞凋亡（P＜0.001）,干扰Cx26后PLM诱导的凋亡率下降（P＜0.001）。Co-IP结果显示,PLM处理后吉非替尼耐药LUAD细胞中Cx26与Bax的相互作用增加。结论PLM可能通过促进Cx26与促凋亡蛋白Bax的相互作用,诱导人吉非替尼原发性耐药与吉非替尼获得性耐药细胞凋亡。