目的：探讨一种适合脂肪间充质干细胞和软骨细胞生长、增殖，并能增强共培养诱导作用的三维立体支架，为扩大和优化软骨组织工程种子细胞提供实验依据，为临床关节软骨损伤修复寻找新载体。　　 方法：　　 1.胶原-壳聚糖支架的制造将质量分数2％的胶原与质量分数3％的壳聚糖混合，溶于1％的乙酸溶液，加入1g/L聚乙二醇，充分溶解，-20℃冷冻24h，冷冻干燥48h，取出支架切成高5mm的圆柱体，中和支架内的醋酸，PBS液反复冲洗，至PH值中性，酒精浸泡，紫外照射后，无菌条件下冷冻干燥24h，制备得胶原-壳聚糖多孔支架。　　 2.脂肪间充质干细胞的提取和鉴定新西兰大白兔，无菌条件下取双侧腹股沟脂肪，剪碎，加入到1g/LⅠ型胶原酶，37℃震荡消化30min，离心、收集细胞，接种于培养瓶中。鉴定：第3代脂肪干细胞(4×106/ml)，滴加CD44、CD29、CD106、CD34兔抗大鼠多克隆抗体，次日弃去一抗，加入山羊抗兔FITC标记的二抗，室温孵育2h后弃去二抗，PBS清洗，荧光显微镜下观察并照相。　　 3.软骨细胞的提取与培养成年新西兰大白兔，常规备皮，消毒，取膝关节股骨髁、胫骨平台软骨组织，剪碎，无菌PBS液冲洗，2.5g/L胰蛋白酶37℃水浴振荡消化30min，中止消化后，加入Ⅱ型胶原酶，37℃水浴振荡消化，分阶段收集细胞，加入高糖的DMEM，倒置显微镜下观察，根据细胞数量多少，分别移入不同大小的细胞培养瓶。　　 4.细胞种植　　 脂肪干细胞和软骨细胞分别传代培育至第三代，取脂肪间充质干细胞(4×106/ml)和软骨细胞(2×106/ml)按体积分数2∶1比例分别接种剑胶原-壳聚糖支架、壳聚糖支架和无支架细胞培养板上。　　 5.电镜检测　　 观察支架的孔径及细胞在支架上的生长情况。通过称量支架吸水前后的重量，计算孔隙率和吸水性。　　 6.MTT法检测一、共培养细胞在不同支架上的增殖活力。二、在相同胶原壳聚糖支架上，不同细胞的增殖情况。　　 7.细胞爬片甲苯胺蓝染色检测把不同支架环境下共培养细胞消化下来，爬片培养，染色观察各组的糖胺聚糖分泌情况。　　 8.PCR检测根据不同支架和不同细胞分九组，检测各组细胞的糖胺聚糖和Ⅱ型胶原RNA表达水平，以区别在胶原-壳聚糖支架下共培养的效果。　　 9.实验分组　　 根据实验设计需要，MTT检测分两组，即共培养细胞接种到3种不同支架上为一组，在同一种胶原-壳聚糖支架上接种不同细胞为二组。免疫组织化学染色检测分3组，即共培养细胞接种到3种不同支架上。RT-PCR检测共分9组，实验组3组（即共培养细胞接种到3种不同支架），基础对照3组（即相同数量软骨细胞接种到3种不同支架），空白对照3组（即相同数量脂肪间充质干细胞接种到3种不同支架）。其中所有分组中软骨细胞接种密度、体积分数均为同一标准，即各组中涉及到软骨细胞的实验组，所用软骨细胞数量均相同，方便对实验结果量的比较。实验中各组脂肪间充质干细胞也为相同数量。　　 结果：　　 1.胶原-壳聚糖支架平均孔径为100-150μm，孔隙率为(88.6±1.5)％，吸水率（96±0.55）％，符合细胞生长、增殖要求。　　 2.细胞形态学观察及鉴定脂肪间充质干细胞7d细胞可达80％～90％融合，10～12d细胞密度增高，细胞排列具有明显方向性，呈漩涡状排列。脂肪间充质干细胞的初步鉴定，免疫荧光法检测CD44、CD29呈阳性反应，阳性率达90％以上，CD106、CD34呈阴性反应，符合脂肪间充质干细胞特性。　　 3.细胞在支架生长的电镜观察和增殖活力检测复合细胞培养两周后，电镜观察细胞贴附紧密、生长良好。MTT法检测结果显示：在该支架上种植的共培养细胞，增殖活力比单纯壳聚糖支架和无支架组强。在此支架上种植两种细胞，增殖活力比单纯培养脂肪间充质干细胞或单独培养软骨细胞强。说明胶原-壳聚糖支架有利于共培养细胞的生长、增殖。　　 4.细胞爬片染色观察三组不同培养方式的细胞经消化爬片染色显示，胶原-壳聚糖支架组的细胞Safranin（番红）染色，toluidine blue（甲苯胺蓝）染色呈强阳性(++++)，单纯壳聚糖支架组呈弱阳性(++)，无支架培养组呈弱阳性(+)，结果表明胶原-壳聚糖支架有增强软骨细胞诱导能力的作用。　　 5.RT-PCR检测在胶原-壳聚糖支架上共培养细胞的糖胺聚糖和Ⅱ型胶原RNA表达水平，明显优于其他对照组。由此可见，在胶原-壳聚糖支架的三维立体培养下，软骨细胞的诱导作用效果明显。　　 结论：　　 1.胶原-壳聚糖支架利于共培养细胞生长和快速增殖，简单、经济、实用，是一种适合脂肪间充质干细胞和软骨细胞共培养的良好载体。　　 2.胶原-壳聚糖支架有增强软骨细胞诱导脂肪间充质干细胞向软骨细胞分化的作用，可以作为构建组织工程软骨的载体。　　 3.初步建立了两种细胞三维立体共培养模型，一定程度上模拟了机体内环境。