目的:肾癌是泌尿系统中第二常见的肿瘤之一,其中,肾透明细胞癌占全部肾癌的80%-90%。肾透明细胞癌癌由于其发病隐匿,常常不能引起人们的高度重视,多数患者为体检时发现,大约有30%的患者在发现时即为晚期,而晚期肾癌的预后往往不良。早期肾癌的常规治疗方案为手术治疗,因其对放疗和化疗不敏感,所以如何提高晚期肾癌患者的生活质量及延长其生存时间,成了当今研究的主流。随着分子生物学的发展,出现了多种针对肾癌的靶向药物,如抗血管内皮生长因子受体VEGFR的舒尼替尼（sutent,Pfizer）,针对mTOR通路的mTOR受体阻断剂依维莫司、特西罗莫司等药物在临床上都取得了巨大的疗效。大大的改善了晚期肾癌患者的生活质量和生存时间。近年来,随着肿瘤交叉学科的发展,肿瘤免疫学成为了研究的热门领域,并为肾癌患者带来了新的福音。发现较早、相对研究最为成熟和备受关注的免疫治疗靶点便是PD-L1/PD-1通路。程序性细胞死亡分子-1受体PD-1（又称CD279）是一种免疫抑制性受体,属于CD28家族成员,它由2号染色体长臂37区3带（2q27.3）的PDCD1基因编码,是一个55KDa的Ⅰ型跨膜蛋白。PD-1在激活的T细胞、B细胞、单核细胞和树突状细胞、自然杀伤细胞表面表达。PD-1与其主要配体PD-L1结合,后者主要表达与造血细胞和肿瘤细胞等的表面,二者结合后产生抑制性信号,抑制了T细胞活性,从而使肿瘤逃脱了宿主的免疫监视,造成疾病进展。目前抗PD-L1/PD-1治疗药物已经被批准应用于临床多种实体瘤的治疗,并取得了良好的临床反馈。但关于肿瘤细胞表面表达PD-L1是否能够作为抗PD-1治疗的分子标志物,以及它与肿瘤患者生存预后之间的关系一直存在着争议。这主要是由于PD-L1在肿瘤微环境中的作用和其调控机制十分复杂。由于肿瘤生长所需要巨大的能量和血管异生,因而大多数实体瘤均暴露于缺氧环境之中。肾透明细胞癌往往体积巨大,因此存在着天然的低氧环境,既往文献报道在缺氧环境之中,肾透明细胞癌的PD-L1主要受到低氧转录因子2α（HIIF-2α）的调控,但关于其他在低氧环境中可能上调PD-L1的机制尚缺乏探讨。以往文献报道低氧可以使组蛋白发生乙酰化,进而导致多种癌基因的激活,那么在肾透明细胞癌中,是否也存在着组蛋白乙酰化调控PD-L1转录表达的机制,是何种机制导致组蛋白乙酰化水平增高,调控组蛋白乙酰化水平与患者的预后有怎样的关系,是否有其他在肾透明细胞癌异常表达的基因与免疫调控相关,与患者的预后关系如何,目前尚缺乏全面的探讨。在本研究中我们针PD-L1在肾透明细胞癌中表达与预后存在的争议在组织学水平进行了探索,并分析了PD-L1在缺氧环境中除HIF-2α以外的调控机制,并研究了PD-L1调控在肾透明细胞癌中与预后的关系,探索了肾透明细胞癌与正常肾组织差异表达基因,并分析了其与免疫调节的关系和预后价值。我们的研究将为肾透明细胞癌患者的诊断及预后评估带来新的科学依据。材料与方法:1.采用蛋白免疫印迹方法检测PD-L1,HIF-2α、Actin、acetyl-Histone等蛋白的表达。2.采用Q-RT-PCR检测PD-L1的mRNA水平。3.免疫组化方法检测肾癌组织标本中PD-L1、HIF-2α、Histone H3K9ac的表达情况。4.利用geo数据库下载肾透明细胞癌差异表达数据集。5.强度排名聚合分析（Robust Rank Aggregation）从各个geo数据集中得到一致并且强健的差异基因,6.应用DAVID网站对差异基因进行go term分析将错误发现率（false discovery rate,FDR）<0.05定义为显著差异。7.通过string数据库构建蛋白蛋白作用网络,并应用cytoscape进行模块分析。其规则为false degree cutoff:2,k-core:2,Node Score cutoff:0.2,haircut:true,Fluff:false,Max Depth from seed:100).8.从TCGA数据库中下载肾透明细胞癌基因表达量（FPKM）文件,分析差异基因和临床信息之间的关系。并通过timer数据库对差异表达基因与肿瘤组织中免疫浸润细胞的关系进行分析。9统计学处理:应用SPSS 22.0统计软件进行卡方检验,Spearman秩相关检验和Fisher精确计算概率法。组间比较应用t检验。每次实验重复3次,数据以均值±标准差（x±s）表示。p<0.05有统计学意义。应用Cox模型进行单因素及多因素的生存分析。结果:1.PD-L1是肾透明细胞癌患者的独立不良因素。（1）我们通过生物信息学网站,对PD-L1与肾透明细胞癌患者的预后进行了分析,结果显示PD-L1对预后的评价存在分歧,多个数据库能够得出截然相反的结论。（2）PD-L1在102例肾透明细胞癌组织中的阳性表达率为56/102（54.9%）。（3）PD-L1表达率在女性患者中要高于男性患者（P=0.005）,PD-L1表达阳性的患者其furhman分级要高于阴性患者（P<0.001）。（4）单因素生存分析结果显示PD-L1阳性的患者总OS更差,（HR=4.61,95%CI为1.54-13.8,P value<0.05）。在多因素cox分析中,PD-L1为患者的独立不良预后因素（HR=3.38,95%CI为1.14-13.09,p<0.05）,此外肿瘤T分期、fuhrman核分级和年龄在本群患者中为独立不良预后因素。2.低氧通过抑制组蛋白去乙酰化酶活性,增强肾透明细胞癌细胞系中组蛋白H3K9ac乙酰化程度,上调PD-L1表达。（1）在经过2%浓度低氧处理24的肾透明细胞癌细胞系ACHN和786-O细胞系中,我们应用western blot检测PD-L1到HIF-2α于PD-L1表达水平增高,同时Q-RT-PCR显示PD-L1mRNA水平增高。（2）我们对ACHN和786-O细胞系中的HIF-2α进行了敲除,发现低氧下两种细胞系PD-L1的表达量没有明显变化。同时PD-L1转录仍然水平增高。（3）应用western blot检测低氧下检乙酰化组蛋白变化,发现低氧下组蛋白H3K9和H3K27两个位点乙酰化水平增高。应用组蛋白去乙酰化酶活性试剂盒检测HDAC整体活性,发现组蛋白去乙酰化酶整体活性受到抑制。（4）加入组蛋白去乙酰化酶抑制剂后PD-L1蛋白和转录水平增加。存在与低氧相同的活化位点H3K9ac。（5）应用DNA元件百科全书ENCODE和UCSC基因组浏览器检测H3K9ac在肾脏中与PD-L1基因CD274的关系,发现H3K9ac大量聚集在PD-L1转录启动区域,说明H3K9ac在肾组织细胞中与PD-L1的转录激活密切相关。3.PD-L1在肾癌组织中表达与HIF-2α和组蛋白H3K9ac正相关,H3K9ac是肾透明细胞癌的独立不良预后因素。（1）应用与评价PD-L1预后相同的102例肾透明细胞癌患者组织样本,对其已知调控因子HIF-2α和我们经验证得出的因子H3K9ac进行组织水平验证。Histone-H3K9ac阳性率为62/102（60.8%）,HIF-2α在102例患者群中的阳性表达率为53/102（51.9%）。（2）组蛋白H3K9ac与肾透明细胞癌fuhrman和分级相关,更高的fuhrman分级中组蛋白H3K9ac表达的阳性率更高（P<0.01）。HIF-2α在本患者群中,更高的T分期中HIF-2α表达的阳性率更高。（P=0.02）。另外肿瘤中心存在坏死组织的病理标本HIF-2α阳性率更高（P=0.03）。（3）spearman相关性分析表明H3K9ac和HIF-2α在患者组织中表达与PD-L1均呈正相关,r值分别为0.321和0.469,p<0.01。（4）单因素分析显示Histone-H3K9ac（HR=7.34,95%CI为1.7-31.68,p=0.014）高表达患者OS更差,HIF-2α与OS无关。在纳入PD-L1和其相关调控因子的COX多因素分析中显示年龄（p=0.029）PD-L1表达（p=0.016）、H3K9ac表达（p=0.028）、及furhman核分级（p=0.013）为独立不良预后因素。在应用数据降维处理的lasso回归中,结果显示,在我们的肾透明细胞癌患者群中,年龄、PD-L1、Histone-H3K9ac、T分期、fuhrman核分级,共同为独立的不良预后因素。4.生物信息学综合分析,得出肾透明细胞癌与癌旁相比6个显著差异表达基因,其中ADCY7、LPAR5表达上调,CXCL12、BDKRB2、CASR、KNG1在肾透明细胞癌中表达下调。（1）基于基因表达汇编（gene expression omnibus,GEO）的基因表达数据集。（2）我们应用了RAA方法总共定义了980个显著的DEG,包括429个上调和551个下调基因。（3）这些差异基因通过生物学功能分析被显著的富集于肿瘤相关的生物学功能和通路之中。（4）应用STRING数据库建立蛋白与蛋白相互作用网络（PPI network）,并应用Cytoscape的MCODE插件在全网络进行模块分析。最终得出肾透明细胞癌中6个差异表达基因。其中ADCY7、LPAR5为肾透明细胞癌中上调基因,CXCL12、BDKRB2、CASR、KNG1为下调基因。5.ADCY7、LPAR5为免疫调控相关基因,与患者不良预后相关。（1）利用哈弗大学TIMER（Tumor Immune Estimation Resource）数据库检测差异基因与肿瘤浸润免疫细胞的关系发现,上调差异表达基因ADCY7、与LPAR5于肿瘤浸润淋巴细胞数量呈正相关,可能为免疫调节基因。（2）应用TCGA数据库中肾透明细胞癌数据集分析ADCY7、LPAR5及免疫浸润细胞的关系结果提示,巨噬细胞高表达提示预后良好,而ADCY7为肾透明细胞癌的不良预后因素。结论:1.低氧微环境能够抑制组蛋白去乙酰化酶整体活性,增加组蛋白H3K9的乙酰化水平,促进肾透明细胞癌中PD-L1的上调。2.PD-L1高表达的肾透明细胞癌患者比低表达患者预后更差,并与其调控因子组蛋白H3K9_ac共同作为肾透明细胞癌患者独立的不良预后因素。3.CXCL12,BDKRB2,CASR,KNG1为肾透明细胞癌中下调的显著差异表达基因,提示肾透明细胞癌患者预后良好。4.ADCY7,LPAR5为肾透明细胞癌癌中上调的显著差异表达基因,并与肿瘤浸润细胞表达正相关,能够提示不良预后。肿瘤中巨噬细胞高表达提示预后良好,ADCY7为独立不良预后因素。