非结核分枝杆菌属于环境致病菌,非结核分枝杆菌病的发病率在不断攀升,已经逐渐引起人们的关注,但对于非结核分枝杆菌的致病机制的相关研究却非常少。非结核分枝杆菌是兼性细胞内寄生菌,因此作为机体防御系统中第一道屏障的巨噬细胞与非结核分枝杆菌的相互作用机制显得尤为重要;另外,以T细胞免疫为主的细胞免疫在抵抗非结核分枝杆菌感染过程中是一个非常重要的环节,T淋巴细胞各亚群的分化比例直接影响机体抵抗非结核分枝杆菌感染的能力。本研究在前期从动物体内分离鉴定20余株非结核分支杆菌的基础上,通过非结核分枝杆菌与小鼠骨髓巨噬细胞共培养,观察非结核分枝杆菌被巨噬细胞的吞噬、增殖情况,筛选出在巨噬细胞内增殖能力较强的母牛分枝杆菌(M.vaccae)和新金分枝杆菌(M.neoaurum)。这两种菌株在临床感染上也都报道过具有一定致病性,但是,目前却没有关于感染M.vaccae和M.neoaurum的免疫机制的研究,我们的目的是用实验室分离出的M.vaccae、M.neoaurum与M.bovis BCG相比较,研究它们的感染特性及宿主的免疫机制,特别是与巨噬细胞凋亡、抗原递呈及CD4~+T淋巴细胞极化相关的免疫机制,进而探讨非结核分枝杆菌感染过程中巨噬细胞及T淋巴细胞的免疫调节作用。M.vaccae、M.neoaurum分别感染小鼠巨噬细胞系RAW264.7,同时设置生理盐水对照组和BCG对照组,分别于感染后0h、4h、12h、24h、48h流式细胞术检测非结核分枝杆菌对小鼠巨噬细胞系细胞凋亡率变化,用荧光定量PCR检测TLR2及TLR4 m RNA的变化,另外,用流式细胞术还测定了非结核分枝杆菌感染后RAW264.7细胞TLR2、TLR4、MHCⅠ、MHC II、CD80、CD86表达量的变化,Elisa法检测非结核分枝杆菌对相关细胞因子TNF-α、IL-10、IL-12p40表达的影响。同时制备非结核分枝杆菌感染动物模型,将M.vaccae和M.neoaurum(1×106 CFU)分别经腹腔注入C57BL/6小鼠体内,分别在感染后2w、4w、6w和8w做肺组织病理切片及抗酸染色,流式细胞术检测非结核分枝杆菌对小鼠肺巨噬细胞表面TLR2、TLR4、MHCⅠ、MHCⅡ、CD80、CD86及巨噬细胞IL-12、TNF-α、IL-10表达的变化。另外,为了探究非结核分枝菌感染对CD4~+T淋巴细胞亚群极化的影响,不同时间点流式检测CD4~+及CD8+T淋巴细胞,用荧光定量PCR检测肺内T-bet、GATA-3、RORγt和Foxp3的m RNA表达量,流式细胞术检测肺内CD4~+T细胞亚群Th1、Th2、Th17和Treg细胞比例,Elisa法检测非结核分枝杆菌对相关细胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-12p40、MCP-1、IL-4、IL-17A、IL-10、TGF-β表达的影响。结果表明,小鼠骨髓巨噬细胞可吞噬实验室分离鉴定的浅黄分枝杆菌(M.gilvum)、M.vaccae及M.neoaurum,吞噬率最高的是M.vaccae(26.2±6.5%)(P<0.05);荧光显微镜下也观察到了大量被巨噬细胞吞噬的非结核分枝杆菌;感染后第4、7天,与M.gilvum相比,M.vaccae和M.neoaurum表现出更强的增殖能力(P<0.001),表明M.vaccae和M.neoaurum相对于M.gilvum毒力及易感性可能更强。M.vaccae及M.neoaurum感染RAW264.7细胞后,发现M.vaccae和M.neoaurum感染均可促进细胞凋亡,并在感染后4h开始上调TLR2、TLR4、MHCⅠ、MHCⅡ及CD80、CD86,与生理盐水对照组相比差异显著(P<0.05);并且也上调了TNF-α、IL-12p40、IL-10的表达(P<0.05)。M.vaccae组的TLR2、TLR4、MHCⅠ、MHCⅡ、协同刺激分子CD80/86及TNF-α、IL-10、IL-12的表达均高于M.neoaurum组(P<0.05),而凋亡水平却低于M.neoaurum组(P<0.05),结果表明毒力强的分枝杆菌诱导细胞的凋亡率却低;但在感染24h以后,TLR2、TLR4、MHCⅠ、MHCⅡ、CD80、CD86、TNF-α、IL-12p40的表达量都有所下降,而抑制性细胞因子IL-10的表达量并没有降低,推断M.vaccae及M.neoaurum为了抵抗巨噬细胞的杀菌作用而抑制细胞表面TLR2、TLR4、MHCⅠ、MHCⅡ、协同刺激分子CD80/86的表达,抑制细胞清除细菌的能力,其中细胞因子IL-10的高表达也是原因之一。通过制备非结核分枝杆菌感染小鼠模型,同样发现M.vaccae和M.neoaurum感染后2w开始上调了肺组织中巨噬细胞表面TLR2、TLR4的表达,进而上调MHCⅠ、MHCⅡ、协同刺激分子CD80/86的表达,与生理盐水对照组相比差异显著(P<0.05);诱导炎性细胞因子TNF-α、IL-12p40的合成与释放,与生理盐水对照组相比差异显著(P<0.05)。感染6w、8w后除了抑制性细胞因子IL-10表达没有下降,其他表达都有所下调,小鼠体内的这些反应与体外M.vaccae及M.neoaurum感染RAW264.7细胞的结果很相似,这些反应可能参与了机体炎症反应和器官功能损害的病理生理过程。另外,我们发现M.vaccae和M.neoaurum感染后对小鼠机体形成了严重的伤害,但伤害程度不同。各感染组体重丢失率存在差异,M.vaccae组体重下降最多(P<0.05),而M.neoaurum组与BCG组相接近(P>0.05)。非结核分枝杆菌感染小鼠后,引起了小鼠肺部严重的病理变化,两个非结核分枝杆菌感染组在感染后2w、4w、6w和8w的肺组织病变程度都要比BCG感染组严重,特别是M.vaccae在攻菌后2w就出现大量的中性粒细胞,4w、6w时有炎性细胞浸润和出血,在8w时,仍旧是肺泡间隔厚,肺泡腔大小不一,依然有炎症细胞;但在4w时,我们发现M.neoaurum组的肺泡壁比M.vaccae组厚,8w时,炎性细胞有所减少,肺泡壁有一定的恢复,仍可见少量肺泡破裂;M.vaccae及M.neoaurum感染组小鼠肺组织的病理切片中均未检测到典型的结核病变,这些病理结果表明虽然非结核分枝杆菌的毒力比结核分枝杆菌的毒力弱,但是它对宿主的肺部也造成一定程度的损伤,因此也应引起我们的重视。抗酸染色及肺内菌体增殖实验都验证了M.vaccae、M.neoaurum以及BCG感染组在感染后2w、4w、6w和8w均可检测到菌体的存在,但菌体数量有差异,经肺组织内菌体培养发现M.vaccae的数量最多(P<0.05)。研究非结核分枝杆菌感染对小鼠肺T淋巴细胞亚群的影响,发现小鼠感染2w开始,M.vaccae及M.neoaurum感染组肺部CD3+CD4~+T淋巴细胞比例呈上升趋势,在4w时达到最高峰(P<0.01),随时间延长开始下降,而到第8w时,M.vaccae及M.neoaurum感染组与生理盐水对照组相比差异不显著(P>0.05),但BCG感染组CD3+CD4~+T淋巴细胞仍然保持较高的水平。M.vaccae及M.neoaurum感染组2w后CD3+CD8+T淋巴细胞比例开始下调,在4w时达到最低(P<0.01),随时间延长开始增加,到第8w时,M.vaccae及M.neoaurum感染组中CD3+CD8+T淋巴细胞比例显著高于生理盐水对照组(P<0.05),但BCG感染组与生理盐水对照组相比差异不显著(P>0.05)。上述结果说明M.vaccae及M.neoaurum感染前期以CD4~+T细胞免疫为主,感染后期以CD8+T细胞免疫为主,而作为对照的BCG组整个感染过程中均升高CD4~+T细胞免疫。同时检测了CD4~+T淋巴细胞各细胞亚群在非结核分枝杆菌感染中的作用,与生理盐水对照组相比,M.vaccae及M.neoaurum感染组在攻菌后2w时,转录因子T-bet和RORγt的m RNA表达显著升高(P<0.05),IFN-γ、TNF-α、IL-12等Th1细胞因子及IL-17A都相应显著增加(P<0.05),同时Th1和Th17细胞比例显著增加(P<0.05)。Th1反应在4w时达到最高,之后开始下降;而Th17反应在2w时就开始了下降。M.vaccae及M.neoaurum在感染前期抑制了转录因子GATA-3、细胞因子IL-4的表达(P<0.05),降低了Th2细胞比例(P<0.05);而在感染后6w、8w时Th2反应增强,Th1和Th17反应相对较低。M.vaccae及M.neoaurum感染促进了Foxp3、TGF-β、IL-10和Treg细胞表达,与生理盐水对照组差异显著(P<0.05),Treg反应呈升高趋势,6w、8w时尤为明显(P<0.05),推测Treg反应的升高可能是感染后期Th1和Th17反应降低的原因之一。另外,6w、8w Th2反应的增也抑制了Th1和Th17反应。此外,M.vaccae引起Th1、Th2、Th17、Treg反应都比M.neoaurum更强,而作为对照组的BCG感染整个过程中Th1反应比较稳定,抑制了Th2反应,使机体损伤有所恢复,同时BCG组的Th17细胞比例、RORγt和Th17A的表达除了在4w时高于生理盐水对照组(P<0.05),其余时间点都与生理盐水对照组差异不显著(P>0.05)。此外,BCG感染组Treg反应不如M.vaccae及M.neoaurum组强烈,从而下调Th1与Th17反应的程度也不如M.vaccae及M.neoaurum,更进一步验证了我们的对M.vaccae及M.neoaurum感染过程中Treg反应升高下调Th1及Th17反应的推测。通过以上的结果我们分析M.vaccae及M.neoaurum感染C57BL/6小鼠过程中,感染2w、4w小鼠肺部巨噬细胞通过TLR2、TLR4识别抗原之后,巨噬细胞表面MHCⅠ、MHCⅡ、CD80、CD86的表达升高,之后将抗原呈递给T淋巴细胞,诱导CD4~+T淋巴细胞比例升高,CD8+T淋巴细胞比例下降;Th1与Th17反应增强,促进分泌Th1与Th17相关细胞因子。但到感染6w时,随着巨噬细胞TLR2、TLR4、MHCⅠ、MHCⅡ、CD80、CD86的表达下降,巨噬细胞抗原递呈功能减弱;Th2与Treg反应增强,Th2与Treg相关细胞因子表达增强,从而抑制Th1与Th17反应。这些实验结果为巨噬细胞及T淋巴细胞在非结核分枝杆菌感染中免疫机制的相关研究奠定实验基础,同时为非结核分枝杆菌病的发病机制提供理论依据,也为诊断和预防非结核分枝杆菌病提供新的思路。