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卵巢癌是人类最难治愈的癌肿之一，尽管许多年来手术、化疗和放疗均已取得了长足的进展，但术后复发和化疗耐药仍然难以突破，晚期卵巢癌的五年生存率始终得不到改善。近些年来，随着细胞工程和基因工程技术的发展，肿瘤免疫治疗亦得以迅猛发展，细胞因子基因治疗（cytokine gene tnerapy）是目前研究的热点。因为卵巢癌难治、易复发，从而成为细胞因子基因治疗的合适模型。白细胞介素7（Interleukin-7，IL-7）是一种较新的细胞因子，起初只认识到它是B细胞生长因子，后来研究发现，IL-7具有与IL-2相似的活性，除了可促进B前体细胞增殖分化外，IL-7也是一种T细胞生长因子，促进CD4+、CD8+T细胞成熟，刺激静息T细胞增殖，并可诱导出一定水平的LAK及CTL活性，IL-7具有的生物学活性意味着它在抗肿瘤方面有着潜在的意义。目前人们对IL-7抗肿瘤作用的研究热点是过继免疫治疗和基因治疗，最近的实验和临床研究表明，将IL-7cDNA导入黑色素瘤细胞、结肠癌细胞、肾细胞癌细胞、纤维肉瘤细胞等，发现转染后肿瘤细胞IL-7高表达，癌细胞免疫原性增加，体内成瘤性下降，淋巴细胞对其杀伤活性明显提高。迄今国内外尚未见IL-7基因治疗卵巢癌的相关报道。本研究将IL-7cDNA基因转染卵巢上皮癌细胞株SKOV3，观察IL-7基因转染前后肿瘤细胞形态、增殖活性、免疫原性、细胞因子分泌以及对LAK细胞的杀伤敏感性的变化，旨在探讨IL-7用于卵巢癌细胞因子基因治疗的潜在价值。 第一部分 人白细胞介素7基因克隆及其真核表达载体的构建 目的：运用分子克隆技术获得人IL-7cDNA并且构建得到人IL-7真核、原核双相表达载体PBK-CMV-IL-7，为下一步将IL-7转染SKOV3细胞作准备。方法：运用 一 RT．PCR技术从人脾组织中获取IL－7cDNA基因，与克隆载体PMD181连接构建 PMD181二L－7重组体，用 BamHI及Hindlll双酶切 pBK－CMV和 PMD18。T－IL7，将 酶切后的 IL－7和 pBK－CMV连接起来构建 hIL－7原核、真核双相表达重组体 pBK－CMV－IL－7，进一步用考马斯亮蓝染色法检测 pBK－CMV－IL－7在原核细胞 DHS a 中的表达。结果：成功获取人IL－7CDNA 基因，经测序证实对码，序列无误； PMD18－T－IL－7和 pBK－CMV－IL－7重组体经PCR和酶切鉴定证实几－7已克隆进表达载 体；经IPTG诱导后，行全菌SDS－PAGE，结果见重组体转化菌株在45KD处有增强 条带。结论：从人脾组织成功构建了人 IL－7克隆重组体 PMD－T－IL－7；利用上述重 组体，成功构建了人IL－7原核、真核双重高效表达重组体pBK－CMV－IL－7，其可在 大肠杆菌 DHS a中，经 IPTG诱导；产生 45KD左右的融合蛋白。 第二部分 稳定表达几－7的SKOV3细胞株的建立 目的：将IL－7cDNA基因转染SKOV3，观察IL－7基因转染前后肿瘤细胞IL－7mRNA 及蛋白的表达，建立稳定表达IL－7的SKOV3细胞株。方法：用脂质体介导法将 pBK－CMV－IL－7基因转染 SKOV3，行 G4旧筛选，并用 RT－PCR、Western Blot及 ELISA 法测定转染后pBK－CMV、IL－7重组体在SKOV3细胞中mRNA和蛋白的表达，同时 以转染空载体pBK－CMV为对照。结果：1．换用选择性培养基后，大部分转染 pBK－CMV－几。7及pBK。CMV的 SKOV3细胞（分别用 SKOV3－IL7和 SKOV3－Neo表 示）在1周后死亡，少数转染细胞继续生长增殖，SKOV3－IL－7细胞在选择培养基中生 长16周仍有抗性，而未转染的SKOV3细胞则在1周后完全裂解死亡。2．基因转染 后8—12周，SKOV3、IL－7、SKOV3．Neo及SKOV3细胞抽提的总RNA，经DNase消 化后，直接PC民未出现IL－7（639hP）及pBK－CMV（226hp）的条带，而以IL－7为引 物的RT－PCR，SKOV3－IL－7细胞出现639hp的阳性条带，SKOV3－Neo及SKOV3细 胞未见阳性条带。以pBK－CMV为引物的RT－PCR，SKOV3－IL、7细胞出现865hp的阳 性条带，SKOV3－Neo出现226hp的阳性条带，SKOV3细胞未见阳性条带。3．基因转 染后10周，SKOV3－IL、7、SKOV3－Neo及SKOV3细胞经裂解后的蛋白，经IL7的 Western blot分析，发现 SKOV3－IL－7细胞有阳性条带出现，而 SKOV3．Neo及 SKOV3 细胞未见阳性条带。经ELISA测定，SKOV3－IL7细胞上清的IL－7分泌量为：50～ 2 浙 江 大 学 硕 士 学 位 论 文310pg／ffil／10‘／24hr，而 SKOV3－Neo及 SKOV3细胞上清中未能检测到 IL－7的分泌。结论：利用脂质体作载体可将IL－7CDNA导入SKOV3细胞；选择培养后的SKOV3－IL－7细胞能稳定表达 几－7mRNA和蛋白，即建立了IL－7 稳定表达的卵巢癌细胞模型SKOV3—IL—7。 第三部分 几－7基因修饰的SKOV3细胞的生物特性、兔疫原性和体