群体感应(QS)是细菌利用自身分泌自诱导剂(Autoinduccr)作为信号分子进行交流的一个过程。根据自诱导剂类型和检测体系，Qs系统可分为三个主要类型，第一个是革兰氏阴性菌LuxI/R型QS系统，该系统以N-酰化高丝氨酸内酯(AHLs)为自诱导剂，简称自诱导剂1(AI-1，Autoinducer-1)。第二类是革兰氏阳性菌中，以修饰过的寡肽作为自诱导剂的QS系统。第三类是杂合型QS系统，该系统产生两种不同的自诱导剂，自诱导剂1(AI-2，Autoinduccr-1)和自诱导剂2(AI-2，Autoinduccr-2)。与其它Luxl/R型QS系统类似，AI-1．也是一类AHLs，AI-2是一种呋喃硼酸二酯，与其它自诱导剂没有相似之处。QS系统参与细菌许多生物学功能的调控，包括抗生素合成、毒性因子产生、胞外多糖合成、质粒结合转移、生物膜形成、孢子形成、生物发光等。在粘质沙雷氏菌(S.marcescens)生理代谢中，QS系统同样具有非常重要的调控功能。例如，以N-酰化高丝氨酸内酯为自诱导物的AI-1信号系统调节初级代谢产物2,3-丁二醇的合成。S.marcescens的次级代谢产物灵菌红素的合成也是由一个涉及高丝氨酸内酯(AI-1)和呋喃硼酸二酯(A1-2)的双组分信号转导系统的复杂网络调控，当然，这个网络调控系统同时还包含GntR转录因子家族的大量调节因子。 本研究对S.marcescens QS系统自诱导物合成、QS系统关键酶基因的克隆定位和分子调控进行了研究，以期从分子层面深入认识S.marcescens的QS机制，为基于QS系统调控的S.marcescens代谢工程研究奠定基础。 1 AI-2信号分子变化分析以及相关基因克隆在不同培养阶段，对AI-2信号分子的变化规律以及影响因素(碳源种类浓度、硼酸等)进行了分析。实验结果表明，葡萄糖对AI-2合成影响最大，添加3.0 g/L的葡萄糖可以刺激S.marcescens产生的AI-2活性是对照的4倍之多。微量硼酸(0.1g/L)的加入，也刺激AI-2的产生，根据本实验结果以及相关文献，可以推测在S.marcescens中，4，5-二羟基-2，3-戊二酮(DPD)是通过结合硼酸盐和去除水分而被环化，再被水合，最后被转换成AI-2信号分子。同时利用反向PCR和分子杂交相结合的方法成功克隆了粘质沙雷氏菌AI-2合成途径三个关键酶基因metK、pfs和luxS，文献检索结果显示这是首次克隆S.marcescens的metK和pfs基因。利用生物信息学软件对三个基因分析得知，MetK、pfs和luxS的开放阅读框长度分别为1155bp(metK)、702bp(pfs)和516bp (luxS)，分别编码384、233和171个氨基酸。MetK、pfs和luxS蛋白分子量分别为41.85、27.67和22.50KD；等电点分别为5.50、5.65和6.07。根据等电点判断，三个酶均为酸性蛋白。利用pET28a<'(+)>载体表达这三个基因，所得蛋ca的大小与预测的分子量基本一致。 2 LuxS启动子的克隆及Quorum sensing依赖型分析将luxS启动子PluxS和发光磷杆菌luxCDABE操纵子融合，构建融合报告载体pPluxS101，对S.marcescenss和S.marcescens/pPluxSl01在不同培养时间的菌体密度、luxS启动子转录活性和AI．2活性进行跟踪分析。实验结果表明,S.marcescens/pPluxS101中AI-2的产生是受合成途径luxS基因转录水平的调节的，AI-2产生最高值和luxs转录的最高点出现在同一时间点，luxS转录模式与AI-2产生模式紧密关联，由此可以初步判定S.marcescens QS系统是luxS依赖型的。 3 AI-1信号系统SpnI/R基因克隆定位及菌株差异性分析利用PCR和Southern blot技术对AI-1信号系统关键基因(SpnI/SpnR)进行了克隆定位。实验研究发现，S.marcescens(H3010)AI-1型QS调控基因SPNI和SPNR分别位于染色体和质粒上，即此菌株的AI-1系统是由染色体和质粒共调节的，这是一种新型的QS调控系统，目前没有报道。由于QS具有菌株依赖性，AI-1系统的差异或许是由菌株差异引起的，我们运用PCR-RFLP方法分析了两类沙雷氏菌菌株的rrn操纵子，结果表明各类菌株的酶切指纹图谱相差很大，并用IGS区含有的tRNA序列也不同，菌株H3010和A3含有5'-16S-tRNA<'Ala>-tRNA<'Ile>-23S-3'，B17则含有5-16S-tRNA<'GIu>-tRNA<'Ile>-23S-3'，或许这种菌株进化过程中的遗传变异导致了不同菌株间QS系统的差异。利用蛋白质分析软件计算可知，SpnI和SpnR蛋白分别~hz08和247个氨基酸组成；分子量分别为24.24和27.99KD：等电点分别为5.29和6.6，两个蛋白均为酸性蛋白。 4 S.marcescens QS系统的调控研究针对S.marcescens QS系统，我们构建了乳糖诱导表达载体和自杀性质粒，采用表达AiiA酶和突变luxS的策略建立了QS系统的调控方法。利用假单胞铜绿菌QS调节系统设计的psB406/psB1075全细胞感应系统S.marcescens AI-1信号分子进行分析可知，AiiA酶能够表达并且能够降解沙雷氏菌产生的AHIs信号分子，根据指示菌的特点，也可以初步判定S.marcescens合成的AHLs信号分子既有长链的也有短链的。同时实验结果还表明，利用自杀性质粒进行基因突变，失活AI-2合成途径关键酶基luxS，阻断AI-2合成的方法也是可行的，与野生菌株相比，突变株产生极少量的AI-2活性，基本可以忽略。 本研究以微生物QS体系分子机制为基础依据，对S. marcescens双信号QS系统的自诱导物合成、QS依赖型、关键酶基因克隆及遗传定位进行了研究，并建立了QS系统的分子调控手段，为研究QS机制与细菌生理问的关联性以及以QS为基础的代谢流改造奠定了基础。