水稻是世界上最主要的粮食作物之一,播种面积占粮食播种面积的1/5,年产量约4.8亿吨,占世界粮食总产量的1/4,全世界二分之一以上的人口以水稻为主食,同时也是我国最主要的粮食作物之一。并且,水稻被列为模式作物,有着很丰富和深入的基因组研究基础。氮素是农作物生产过程中最主要的限制因子。硝态氮（NO₃^-）和铵态氮（NH₄⁺）是植物从土壤中吸收的两种主要的无机氮源。虽然水稻主要生长在淹水的条件下,但是由于具有非常发达的通气组织,可以将地上部的O2运输到根中,然后分泌到根际,供给根际硝化细菌生长繁殖,进而将根际的NH₄⁺转化成NO₃^-。实际上,水稻生长在NH₄⁺和NO₃^-混合的环境中。而且,在水稻生长的后期,干湿交替的灌溉方式会大大增加根际NO₃^-的含量。为了适应多变的环境,植物进化出了低亲和（LATS）和高亲和（HATS）两个NO₃^-转运系统,分别由低亲和NO₃^-转运蛋白NRT1/PTR（NPF）家族成员和高亲和NO₃^-转运蛋白NRT2家族成员负责。对水稻NO₃^-转运蛋白的研究主要集中在NRT2家族成员,而对NRT1/PTR（NPF）的研究相对较少。本实验以水稻低亲和NO₃^-转运蛋白基因OsNPF2.4为研究对象,通过qRT-PCR、GUS报告基因和eGFP报告基因分析了OsNPF2.4的表达模式;利用非洲爪蟾卵母细胞异源表达系统和电生理技术分析了OsNPF2.4对底物的吸收特性;RT-PCR、qRT-PCR和Southern blot鉴定了OsNPF2.4敲除突变体和超表达材料及相关基因的表达;15N示踪分析了OsNPF2.4敲除突变体对NO₃^-的吸收和再分配；测定了植株和木质部伤流液中NO₃^-和K+含量,分析了OsNPF2.4敲除突变体中NO₃^-的运输对K+运输中的影响;田间试验分析了OsNPF2.4敲除突变体和超表达材料的农艺学性状。主要研究结果如下：1.利用生物信息学和qRT-PCR分析发现,OsNPF2.4基因开放阅读框由两个内含子和三个外显子组成,编码一个由583个氨基酸组成的蛋白质,其表达的蛋白质定位在质膜上,有12次跨膜结构。OsNPF2.4的表达受高浓度NO₃^-和通O2的诱导,在根、茎干和叶鞘中受缺K+抑制,而在叶片中受缺K+诱导。在持续供应NH₄⁺或NO₃^-后缺氮处理会使老叶中OsNPF2.4的表达上调。2.通过OsNPF2.4启动子融合GUS报告基因,然后通过水稻转基因技术转到水稻中检测不同部位GUS活性,结果发现,OsNPF2.4在根中除了根尖以外的其他部位均有表达,在根茎结合处的维管束、叶鞘、叶片、花粉、刚萌发的幼芽和颖壳中均有表达。切片分析发现,OsNPF2.4主要在根的表皮细胞、木质部薄壁细胞和韧皮部伴胞以及叶片韧皮部细胞中表达。3.利用爪蟾卵母细胞异源表达系统和电生理技术分析,结果表明,OsNPF2.4是一个pH依赖的低亲和NO₃^-转运蛋白,它只有在低pH（5.5）时具有吸收NO₃^-的活性,而在高pH（7.4）时则完全丧失对NO₃^-的吸收活性。OsNPF2.4没有NO₃^-的外排活性。电生理结果显示,OsNPF2.4没有吸收小肽的活性。4.通过研究OsNPF2.4敲除突变体和超表达材料对NO₃^-的吸收分析发现,OsNPF2.4的敲除会减少水稻对NO₃^-的吸收,而超表达则会增强水稻对NO₃^-的吸收。在瞬时吸收实验中,供应高浓度15N-NO₃^- （2.5 mM）时OsNPF2.4敲除突变体对15N-NO₃^-的吸收速率显著低于野生型,而供应低浓度15N-NO₃^-（0.25mM）时OsNPF2.4敲除突变体对15N-NO₃^-的吸收速率与野生型相比没有显著差异。但是在长时间低浓度NO₃^-培养过程中我们发现,OsNPF2.4敲除突变体对NO₃^-的吸收明显低于野生型,通过分析水稻高亲和NO₃^-转运蛋白基因表达发现,这是由于在OsNPF2.4敲除突变体中OsNAR2.1和OsNRT2.1的表达下调造成。有意思的是我们发现,当NO₃^-的供应浓度从0.25 mM增加到2.5 mM时野生型水稻的根,茎干叶鞘,叶片的生物量和总氮量增加了20%-35%,而OsNPF2.4敲除突变体的生物量和总氮含量并没有明显增加。这说明OsNPF2.4在水稻对高浓度NO₃^-的吸收中起关键的作用。5.对15N-NO₃^-从老叶向倒一叶、茎干和叶鞘、根中的转运分析发现,与野生型相比,OsNPF2.4敲除突变体中15N-NO₃^-从老叶向倒一叶、茎千和叶鞘、根中的转运严重受阻,这些部位的15N含量比野生型减少了50-60%。而且,OsNPF2.4敲除突变体中15N-NO₃^-从地上部向地下部的转运也受阻,根中15N含量在这三个部位所占的比例明显低于野生型,而茎干和叶鞘、倒一叶中15N含量在这三个部位所占的比例明显高于野生型。超表达OsNPF2.4会显著增加水稻对高浓度NO₃^-的吸收。6.通过对OsNPF2.4敲除突变体和野生型木质部伤流液中的NO₃^-和K+含量的分析发现,在供应低浓度NO₃^-（0.25 mM NO₃^-,1 mM K+）的情况下,OsNPF2.4敲除突变体木质部伤流液中NO₃^-和K+的浓度与野生型相比没有显著差异,而在供应高浓度NO₃^- （2.5 mM NO₃^-,1 mM K+）的情况下,OsNPF2.4敲除突变体木质部伤流液中NO₃^-和K+的浓度比野生型分别降低了42%和27%。而在缺N03-和K+2h后木质部中的N03-的转运速率只有野生型的45%,而在缺NO₃^-和K+ 4 h后木质部中的N03-的转运速率与野生型相比没有显著差异。同时,K+在OsNPF2.4敲除突变体木质部中的转运速率也显著低于野生型,而且随着缺NO₃^-和K+时间的延长差异变大。OsNPF2.4敲除突变体根、茎干和叶鞘中的K+浓度显著低于野生型,而且地上部和地下部K+含量的比值明显高于野生型。而在供应低浓度NO₃^-（0.25mM NO₃^-;1 mMK+）的情况下则没有这一现象。综上所述,OsNPF2.4是一个pH依赖性的低亲和NO₃^-转运蛋白,主要负责高浓度NO₃^-情况下水稻对NO₃^-的吸收。而且OsNPF2.4的敲除会影响水稻体内的NO₃^-和K+的穿梭运输。