论文部分内容阅读
目的：面神经的损伤在临床上较为常见，且损伤后很少能达到完美的功能恢复，严重影响患者及家属的心身健康及生活质量。随着干细胞研究的深入，利用骨髓干细胞对脊髓和颅脑损伤的治疗频频见于文献报道，但利用干细胞进行外周神经损伤的治疗报道较少。本研究旨在通过动物实验和分子生物学技术观察DPSCs与TGF-β3联合干预对于面神经损伤的修复效果，并探讨其作用机制，为治疗面神经损伤提供新的方法。方法：（1）从新西兰幼兔前牙及磨牙牙髓组织中分离DPSCs进行体外培养，测定细胞克隆形成率、生长曲线、细胞爬片行HE染色、抗Vimentin、抗osteonectin、抗DSP、抗CD44免疫组化染色，鉴定DPSCs的增殖能力和多分化潜能的生物学特征。（2）12只普通级瞬目反射正常的成年健康新西兰大白兔，面部两侧自身对照，随机分为自身正常对照组和上颊支缺损模型组，各组l2侧。于建模后7d、14d分别行光镜、电镜组织病理学检测，结合动物行为学观察、神经电生理检测技术对面神经上颊支缺损模型进行评价。（3）成年健康新西兰大白兔48只（共96侧面神经），随机抽取24只（共48侧面神经）右侧设为TGF-β3+DPSCs实验组（共24侧面神经），左侧设为TGF-β3对照组1组（共24侧面神经），另外24只新西兰大白兔（共48侧面神经）右侧设为正常对照组（共24侧面神经），左侧设为PBS对照组2（共24侧面神经），分别制作面神经上颊支7mm缺损、损伤局部硅胶管套接的动物模型。于术后1周、1月、3月分别行大体形态、光镜、电镜组织学观察、神经电生理检测、GFAP和S100免疫组织化学染色等检测。结果：第一部分：1)原代培养的幼兔牙髓细胞多呈成纤维细胞样细胞，少数纺锤形或多角形，光镜下传代培养的细胞形态特点与原代培养无明显差异；从第1代到第3胞活率细胞数比分别为：94.7%、95.8%、95.2%；牙髓干细胞在低密度接种后能够形成克隆，幼兔牙髓细胞克隆集落形成率为10-21个/103细胞；2)幼兔牙髓细胞体外多次传代仍具有良好的增殖能力，24孔板计数法表明兔牙髓细胞潜伏期短，随后进入对数增长期，选取的第三代细胞均在五天达到对数生长期，约在第8天细胞达到平台期；细胞周期的测定结果为：G1期DNA含量占80.4%；G2期DNA含量占15.3%；S期DNA含量占4.3%；3)原代和次代克隆，免疫细胞化学对未经诱导的细胞进行表面标志物Vimentin、CD44、osteonectin、dsp鉴定，结果均为染色阳性。第二部分：1)12只实验动物建模过程均较顺利，术中面神经暴露良好，操作可重复性佳。切口均获得I期愈合，动物在研究期间未发生切口感染及并发症，无实验兔死亡，动物存活率100%，建模成功率达100%；2)建模后所有实验动物术侧均出现面神经麻痹症状，2周时术侧面部轻度萎缩，兔唇明显偏向健侧；术后2周面部胡须运动功能评分，术侧分值为0.25±0.05，与健侧分值4分比较，差异有统计学意义（t=-249.16，P＜0.05）；3)面神经电生理检测结果显示，建模后1周、2周时，实验兔健侧组正常面神经潜伏期为（1.47±0.42）ms，神经动作电位最大波幅为（11.32±5.36）mV；刺激术侧组面神经中枢侧断端，不能引起同侧上唇方肌收缩；实验兔术侧面神经动作电位均未能引出；4)健侧组面神经HE染色可见，正常面神经上颊支纤维呈长条形，排列整齐，髓鞘密集，无退变，神经外膜连续；手术组面神经断端可见神经纤维连续性中断，断端部分脱髓鞘改变，神经外膜松散，神经纤维肿胀，板状层结构疏松，轴突呈空泡状；5)电镜观察显示，正常面神经轴突排列整齐，均匀一致，髓鞘结构完整、厚度较均匀、呈致密板层排列，胞核清晰；术后1周模型组神经鞘膜解离，板状结构变得模糊以致消失形成椭圆形小体，出现神经纤维球，轴浆内呈低电子密度；术后2周模型组轴突明显肿胀，其内微管、微丝数目明显减少，线粒体肿胀呈空泡样，电子密度降低；神经纤维排列紊乱，神经外膜连续性中断板层脱离。第三部分：1)术后3月大体形态观察发现，与对照组1、2比较，实验组再生神经直径与近、远端神经干相当，无神经瘤形成，外膜血管丰富，质地坚韧；2)HE染色，术后3月实验组神经纤维排列较整齐，胞核浓密，束间血管多；对照组1神经纤维萎缩，再生神经纤维较少，扭曲较明显，呈盘旋状；对照组2部分轴突消失，神经纤维排列紊乱、髓鞘厚薄不均；3)电镜结果显示实验组的再生纤维以有髓神经纤维为主，形态规则，髓鞘板层结构清晰，轴浆内细胞器丰富；对照组1再生纤维髓鞘发育稍差，有髓神经纤维形态较规则，轴浆内细胞器较丰富；对照组2再生纤维髓鞘发育不良，板层结构紊乱，有髓神经纤维形态不规则，可见到变性的神经纤维；4)图像分析显示，实验组再生神经纤维总数多于其他两个对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组再生神经纤维直径远远大于其他两个对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；实验组再生神经髓鞘厚度远远大于其他两个对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；5)神经电生理检测显示，实验组神经肌肉动作电位的潜伏期明显短于其他两个对照组[实验组（1.96±0.32）ms，对照组1（2.35±0.41）ms，对照组2（3.42±0.55）ms，P＜0.05]，而实验组神经肌肉动作电位的波幅明显高于其他两个对照组[实验组（11.06±3.25）mv，对照组1（8.40±1.68）mv，对照组2（4.62±0.77）mv，P＜005]；6)免疫组化结果显示，各处理组面神经核中均出现GFAP阳性细胞，且术后7天GFAP阳性细胞数TGF-β3+DPSCs实验组＞TGF-β3对照组1＞PBS对照组2（P＜0.05）；各处理组面神经中均出现S100阳性细胞，且S100阳性细胞数TGF-β3+DPSCs实验组＞TGF-β3对照组1＞PBS对照组2（P＜0.05）。结论：（1）本研究所培养的DPSCs增殖能力强，具有稳定的生物活性，可适应长期大量培养的需要。（2）在传代第一代、第二代及第三代形成的克隆细胞率最高，可以选择前三代形成的克隆球进行细胞移植治疗。（3）本研究建立的兔面神经上颊支缺损动物模型，制作简便、性质稳定、可重复性好、术后动物存活率和模型成功率高，且评价方法系统、可靠。（4）DPSCs可以作为种子细胞应用于外周神经组织工程。（5）TGF-β3与牙髓干细胞联合应用能显著提高面神经损伤后修复的效果。（6）用医用硅胶管、胶原蛋白海绵、DPSCs和TGF-β3制备的人工神经符合神经组织学结构，对面神经缺损修复有效，为周围神经缺损的修复提供了一种新方法。