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目的:目前肺癌的发病率和死亡率在全世界恶性肿瘤中排名首位,是肿瘤相关性死亡的首要原因,占全球肿瘤相关性死亡26%。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)作为最常见的病理类型,占全部肺癌病例的80%以上,大约一半以上的NSCLC在被确诊时已为局部进展或远处转移的晚期肺癌,从而失去手术机会。因此,放射治疗在NSCLC的治疗中占有十分重要地位。但是,尽管目前放射技术在不断进步提高,放疗的疗效却仍不尽如人意,肿瘤的内源性或获得性放射抵抗是导致放疗失败的重要因素。肿瘤细胞放射抵抗的发生涉及很多分子机制,例如信号通路的异常调节(如PI3K/AKT、NF-κB等)、DNA损伤修复的增强、EMT、miRNA或lncRNA的表达异常、肿瘤微环境的改变(如乏氧)等都参与肿瘤的放射抵抗。近些年来大量的研究证明非编码RNA(non-coding RNA,ncRNA)参与调控肿瘤的放射抵抗,包括DNA损伤修复、细胞周期调控、细胞凋亡和放射介导的肿瘤死亡等。迄今为止,NSCLC内源性及获得性放射抵抗的确切分子机制仍未被完全阐明。因此,探索NSCLC发生放射抵抗的分子机制从而寻找放射增敏靶点,对提高NSCLC放疗有效率、改善患者生存有着重要的临床意义。mi R-141是miR-200家族成员之一,在NSCLC的发生发展中发挥重要作用,研究显示其在人肺癌组织中过表达,是肿瘤不良预后的风险因素之一。同时miR-141被发现与肺癌对治疗的反应有关,其高表达能促进NSCLC顺铂耐药。NFIA为转录因子NFI家族成员之一,其可通过对靶基因的转录调控来调节细胞增殖、分化,其功能失调可参与肿瘤的发生与进展。在NSCLC中,NFIA的下调能促进肿瘤增殖和迁移,而且NFIA的表达缺失可引起口咽鳞癌放化疗抵抗,还有研究发现NFIA能介导乳腺癌的内分泌耐药。因此本研究在高通量测序结果的基础上,为评估miR-141及NFIA是否影响NSCLC放射敏感性及其作用机制做了以下研究。研究方法:第一部分:本研究首先利用CCK-8实验及克隆形成实验检测四种不同病理亚型的NSCLC细胞系(腺癌细胞系A549、H1975,鳞癌细胞系H226,大细胞癌细胞系H460)放射生物特性,评估不同NSCLC细胞的放射敏感性;然后利用X射线剂量梯度递增法照射H226、H460、A549细胞系,构建NSCLC放射抵抗细胞系,并进一步采用克隆形成实验对放射抵抗细胞系进行鉴定,利用CCK-8实验、流式细胞仪进行细胞周期检测及细胞凋亡检测初步探索放射抵抗细胞系放射抵抗机制;进一步基于转录组学技术测序筛选NSCLC放射抵抗细胞系和亲本细胞系差异表达的lncRNA、miRNA及mRNA,并对差异表达的mRNA及miRNA靶基因进行基因本体(gene ontology,GO)和KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)生物信息学分析;筛选出在两组放射抵抗细胞系中均差异表达且与肿瘤相关的基因,通过实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)检测,验证测序结果的准确率。第二部分:通过分析测序结果及查阅文献,发现放射抵抗细胞系中表达上调的miR-141和表达下调的NFIA可能参与放射抵抗。首先利用qRT-PCR检测不同的NSCLC细胞接受X射线照射后miR-141表达的变化;然后利用慢病毒转染A549和H226细胞构建miR-141低表达稳转细胞系,采用CCK-8实验检测抑制miR-141对细胞增殖活性的影响,CCK-8实验、克隆形成实验、细胞划痕实验及凋亡实验检测抑制miR-141联合电离辐射对细胞放射敏感性的影响;Western blotting实验检测抑制miR-141后凋亡相关蛋白Caspase3、Bax及P53表达变化,检测抑制miR-141对AKT、ERK磷酸化水平的影响;Western blotting实验检测放射抵抗细胞系与亲本细胞系中NFIA的表达差异及AKT、ERK磷酸化水平差异,检测抑制miR-141对NFIA表达的影响;应用质粒转染NFIA低表达的H226R、H460R细胞使NFIA过表达,转染NFIA高表达的H226、H460细胞敲除NFIA,qRT-PCR及Western blotting实验验证转染效率;克隆形成实验及细胞凋亡实验检测过表达或敲除NFIA对细胞放射敏感性的影响;免疫荧光实验检测NFIA过表达的细胞接受照射后γH2AX焦点数目以评估NFIA对细胞DNA损伤修复能力的影响;Western blotting实验检测过表达或敲除NFIA后对AKT、ERK磷酸化水平的影响。结果:第一部分:1、不同病理亚型的NSCLC细胞具有不同放射生物学特性,放射敏感性由高至低依次为:H226、H460、H1975、A549;2、成功筛选出NSCLC放射抵抗细胞系H226R及H460R,对比亲本细胞系,放射抵抗细胞系接受X射线照射后的克隆形成能力更强、生存分数更高,表明具有放射抵抗性;进一步实验证明H226R和H460R细胞通过抑制细胞死亡、改变细胞周期再分布及减少辐射诱导的细胞凋亡来增加其放射抵抗性;3、高通量测序分析差异表达的lncRNA、mRNA以及miRNA,H226R组细胞中共得到47个lncRNA(23个上调和24个下调)、503个mRNA(193个上调和310个下调)和208个miRNA(120个上调和88个下调)差异表达,H460R组细胞中共得到122个lncRNA(46个上调和76个下调)、838个mRNA(508个上调和330个下调)和203个miRNA(95个上调和107个下调)差异表达;4、GO富集分析显示这些转录本主要是在外界刺激的反应、生物调节和粘连、分子功能调节、转录因子活性、细胞的信号传导、细胞增殖、分化及黏连、细胞死亡及细胞运动等过程中富集;通过KEGG通路富集分析发现两组细胞中差异表达的mRNA主要富集在焦点粘附、PI3K/AKT、ECM受体等信号通路,两组细胞差异表达的miRNA预测靶基因主要在Ras、mTOR、MAPK、TNF、PI3K/AKT信号通路、癌症相关信号通路和凋亡的信号通路中显著富集;5、qRT-PCR检测NEAT1、DDX10、PHLDB2、NFIA、miR-146a、miR-205、miR-141、miR-200a、miR-200b及mi R-200c在放射抵抗细胞系及亲本细胞系中的差异表达,与测序结果一致。第二部分:1、不同NSCLC细胞接受电离辐射后miR-141表达均出现上调,且A549、H226及H1975细胞在照射后24 h出现mi R-141表达高峰,48 h表达回落,H460细胞中miR-141表达随照射后时间推移逐渐升高;2、构建miR-141稳定低表达的A549和H226细胞系,发现抑制miR-141表达降低肿瘤增殖活性;抑制miR-141联合电离辐射能通过降低细胞的增殖活性、降低照射后细胞的迁移能力及促进电离辐射诱导的细胞凋亡来增加肿瘤的放射敏感性,且miR-141表达抑制后NSCLC细胞中AKT及ERK活性降低;3、通过TargetScan及DIANA生物信息学数据库预测NFIA为miR-141的靶基因之一,在A549和H226细胞中抑制miR-141后NFIA表达上调;放射抵抗细胞系中NFIA表达显著下调并伴随AKT、ERK活性增强;4、分别对放射抵抗细胞H226R、H460R和亲本细胞H226、H460进行过表达或敲除NFIA,克隆形成实验证实在H226R和H460R细胞中过表达NFIA使放射抵抗细胞恢复放射敏感性,反之,在H226和H460细胞中敲除NFIA使放射敏感性降低,且放射敏感性的改变与辐射诱导的凋亡水平变化及DNA损伤修复能力的改变有关;过表达NFIA使AKT及ERK磷酸化水平降低,敲除NFIA使AKT及ERK磷酸化水平升高。结论:1、利用剂量梯度递增法成功构建NSCLC放射抵抗细胞系H226R和H460R,并通过高通量测序方法筛选出了亲本细胞株和放射抵抗细胞株差异表达的lncRNA、mRNA以及miRNA,进一步生物信息学分析发现差异表达的基因通过调控相关信号传导通路参与NSCLC放射抵抗过程;2、抑制miR-141表达能增强NSCLC放射敏感性;3、miR-141通过靶向NFIA介导AKT、ERK通路调节NSCLC放射敏感性。