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背景研究发现子宫内发育异常会增加出生后患肾脏疾病风险,慢性肾脏病可因子宫内异常环境侵害而在生命早期就出现。越来越多的证据表明,肾脏发育会在不良条件下启动异常编程,从而导致永久性的结构和功能改变。目前,环境污染已被视为肾脏疾病危险因素,其中农药污染在国内是一个突出的问题。Notch信号通路是已知的肾脏发育相关重要通路,其中NOTCH2主要参与肾近端小管分化。此外,Notch通路还介导肾脏疾病发展,在纤维化肾脏中表达上调。据报道,Notch通路上游分子去整合素金属蛋白酶10(A disintegrin and metalloproteinase domain10,ADAM10)也参与肾脏纤维化的发生发展。然而,ADAM10如何通过Notch信号通路介导肾脏纤维化,具体机制尚未完全阐明。目的本研究旨在探索ADAM10-Notch信号轴在肾脏近端小管发育及肾脏纤维化中的作用,以发现可早期干预从而预防慢性肾脏病的潜在靶点。方法8周龄ICR小鼠构建孕期亚中毒剂量毒死蜱(CPF)暴露模型,实验组小鼠从孕7.5天开始连续皮下注射5 mg/kg/d CPF5天,对照组注射同等体积DMSO。显微镜下分离获得12.5天(E 12.5)、14.5天(E 14.5)、16.5天(E 16.5)、18.5天(E 18.5)胚胎肾脏标本;子代小鼠于4周(4 w)、8周(8 w)、6月(6 m)、9月(9 m)处死并留取肾脏、血液标本。不同时间点胚胎肾脏样本进行转录组测序(RNA-seq),利用基因集富集分析(GSEA)探索Notch信号通路富集情况。对不同发育时间点正常胚胎肾脏进行Notch信号通路基因芯片筛查,明确Adam10与Notch分子间的表达趋势关系。进一步检测胚胎肾脏及成年期肾脏Adam10、Notch通路及纤维化相关因子基因蛋白表达情况。利用反义寡核苷酸Morpholino阻断Adam10(Adam10-MO)表达,观察体外培养胚胎肾脏发育情况及肾近端小管分化、Notch通路活性变化情况。人293T细胞敲减和过表达ADAM10并观察Notch通路活性及纤维化相关因子表达变化。81名经肾穿刺病理确诊的Ig A肾病(Ig AN)患者,根据肾穿刺切片Masson染色将纤维化程度分层,免疫组化对ADAM10和NOTCH2进行表达评分,利用卡方检验、相关性分析、Logistic回归分析探索ADAM10、NOTCH2表达与Ig AN纤维化程度、肾功能关系。结果胚胎肾脏RNA-seq测序结果提示Notch通路在产前CPF暴露组小鼠胚胎肾脏中富集。GSEA分析还发现近端小管标志物Aqp1在CPF组富集,而肾单位祖细胞相关标志物表达下调。Notch芯片结果表明Adam10与Notch受体Notch1、Notch2表达趋势一致。RT-q PCR、WB验证Adam10、Notch1、Notch2在CPF组表达升高,肾单位祖细胞标志物Six2在CPF组表达下降。免疫荧光、免疫组化明确CPF处理组小鼠肾近端小管数量增加。体外培养胚胎肾脏经Adam10-MO处理后,肾脏发育受阻,近端小管数量减少,Notch通路活性下降。出生后CPF组小鼠肾脏中,持续存在Adam10、Notch1、Notch2、Aqp1表达升高,近端小管数量增加;此外,CPF组6m和9m肾脏出现自发性肾纤维化,Masson染色纤维化面积增加,间充质标记物表达上调,表现出上皮间质转化(EMT)改变。人293T细胞转染si RNA-ADAM10后,Notch活性无明显下调,纤维化标志物无明显下降,同时转染ADAM10同家族ADAM17的si RNA后,Notch活性下调、纤维化标志物表达下调;转染过表达质粒pc DNA-ADAM10-HA后,Notch活性上调、纤维化标志物表达上调。卡方检验分析表明Ig AN患者中ADAM10表达与NOTCH2表达显著相关;ADAM10、NOTCH2表达与肾纤维化程度显著相关;ADAM10表达与血清肌酐水平、Cystatin C水平、e GFR水平显著相关。相关性分析表明Ig AN患者中ADAM10表达与NOTCH2表达正相关;ADAM10、NOTCH2表达与纤维化程度正相关;ADAM10表达与血清肌酐水平、Cystatin C水平、血尿素氮水平正相关,与e GFR水平负相关。单因素回归分析表明ADAM10表达水平、血清肌酐水平、血尿素氮水平、e GFR水平、Cystatin C水平与Ig AN肾纤维化相关,进一步的多因素回归分析表明ADAM10表达水平和e GFR水平是Ig AN肾纤维化的独立危险因素。结论产前毒死蜱暴露小鼠胚胎肾脏中,ADAM10-Nocth信号轴活化,导致肾单位祖细胞向肾近端小管过度分化。这种异常的近端小管数量增加表型在成年后小鼠肾脏中持续存在。ADAM10-Nocth轴的持续活化,促进6月龄小鼠出现自发性肾纤维化。人293T细胞敲减和过表达实验证实ADAM10在纤维化中的作用。Ig AN患者中,ADAM10、NOTCH2表达与肾纤维化程度相关,且ADAM10表达增高与肾功能减退相关。表明ADAM10可能是潜在的可以早期干预预防慢性肾脏病肾纤维化的靶点。