目的:SARS-CoV-2是一种单股正链RNA病毒,其导致的新型冠状病毒肺炎由于高传染性导致了全球疫情爆发。截止目前,病毒变异株仍威胁着人类健康和生活乃至社会经济发展。新型冠状病毒非结构蛋白NSP13是一种进化高度保守的解旋酶,负责打开双链核酸底物,在病毒复制过程中有着至关重要的作用。所以NSP13被研究人员认为是一个极具潜力的抗病毒靶标。NSP13的N端为锌结合结构域（Zinc-binding domain,ZBD）,C 端为解旋酶区域（helicase）,两者由 stalk 结构域连接。尽管目前其蛋白质晶体结构已被解析,但NSP13的stalk结构域在解旋酶中发挥作用的机制尚不清楚。我们旨在阐明stalk结构域是如何参与NSP13发挥解旋酶功能的这一科学问题。方法:NSP13是一种ATP酶活性依赖的解旋酶。首先,利用ATP酶活性检测试剂盒通过孔雀石绿定磷法对其ATP酶活性进行检测。我们建立了一个基于荧光共振能量转移原理的体外双链RNA解链系统,通过实时动力学研究NSP13的解旋酶活性。利用RNA pulldown的实验技术比较了 NSP13野生型及其突变体蛋白的核酸结合情况。在蛋白质的稳定性上,利用热漂移实验对NSP13野生型蛋白以及突变体蛋白进行蛋白质热稳定性的检测。结果:在建立NSP13解链系统后,我们对NSP13的基本性质进行了探究。我们发现,当缺失stalk结构域时,NSP13由于ATPase酶活性的丧失而失去了其解链活性,这证明了 stalk结构域对NSP13解旋酶活性的必要性。随后,为了探讨stalk结构域的柔性或刚性连接对解旋酶活性的影响,我们在ZBD和stalk或stalk和 helicase 之间插入了一个短的柔性 linker（Z-linker-SH 和 ZS-linker-H）。首先,linker插入突变体（Z-linker-SH和ZS-linker-H）均不影响ATPase酶活性。有趣的是,只有当linker插入stalk和helicase之间（ZS-linker-H）时,NSP13才会失去解链活性;而linker插入ZBD和stalk之间（Z-linker-SH）时,对解链活性并没有影响。其分子机制是ZS-linker-H突变体影响了核酸结合。并且,ZS-linker-H的蛋白质的热稳定性明显降低。结论:我们的研究结果证明了 stalk结构域对NSP13发挥解旋酶功能至关重要,并且stalk结构域介导的与helicase之间的刚性连接很重要。这项工作解释了 NSP13 stalk结构域介导的解链活性的分子机制,有助于阐明NSP13在病毒复制过程中发挥解旋酶功能的具体运作机制以及为新型冠状病毒的药物设计和疫苗研发提供思路。