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研究背景染色体异常包括倍数改变、非整倍性改变、结构改变和微小片段重复和缺失(≤10 Mb)等。染色体异常在临床中与胚胎种植失败、早期妊娠丢失、孕期引产甚至缺陷儿出生息息相关,因此有效地开展植入前遗传学检测(preimplantation genetic test, PGT)对保证不孕夫妇拥有健康的后代有重要意义。近十年,大多生殖中心采用芯片技术,如比较基因组杂交芯片(array comparative genomic hybr i d i zat i on,aCGH)和单核苷酸多态性芯片(single nucleotide polymorphism array,SNP array),进行PGT。近5年,二代测序(next generation sequencing, NGS),如拷贝数变异测序(copy number variation sequencing, CNV-Seq),是一种新兴的前沿技术,其临床应用逐渐开展,并且在辅助生殖临床工作中已经证明对胚胎植入前遗传学筛查(preimplantation genetic screening, PGS)和胚胎植入前遗传学诊断(preimplantation genetic diagnosis, PGD)有重要作用。PGS主要筛查染色体非整倍性改变。同时,临床工作中由于一些小的片段的重复和缺失(≤10 Mb)导致产前诊断中发现异常进而流产引起了我们的注意。目前,已经有研究证明CNV-Seq在基因组水平诊断染色体疾病的价值,其在PGD和PGS中的价值也有探索,但很少有关于CNV-Seq在细胞水平的重复性、分辨率以及与染色体疾病相关的微小重复、缺失的检测的报道。因此我们确立了本研究：探索CNV-Seq在PGT领域全面检测染色体疾病中的意义。研究目的1.证实CNV-Seq在基因组水平诊断染色体疾病的价值及在33 pg稀释基因组和单细胞水平诊断的稳定性；2.明确CNV-Seq在细胞水平的重复性、诊断异常时拷贝数(copy number, CN) cut-off点和细胞水平的分辨率；3.建立胚胎植入前活检的细胞模型；4.以CNV-Seq为主要诊断手段对寻求遗传学诊断的不孕夫妇的胚胎进行染色体疾病的全面检测。研究方法1.在基因组水平,比较CNV-Seq和aCGH在检测6个CNVs (6.52 Mb-93.02 Mb)的一致性,证实CNV-Seq在基因组水平诊断染色体疾病的价值。随后进一步降低模板量到33 pg稀释基因组和单细胞,进行全基因组扩增(whole genome amplification, WGA),用产物作为测序文库构建的底物,探索33 pg稀释基因组和单细胞水平诊断的稳定性：2.选用上一部分在三个水平都准确检测到的6.52 Mb缺失和14.76 Mb的重复(aCGH诊断)作为研究样本,用CNV-Seq为诊断手段在基因组水平进行3次重复,而后分别进行15次五细胞和单细胞WGA产物重复测序,统计不同水平的两个已知异常区域拷贝数值(copy number value, CN value),各个水平差异以均数±标准差(Mean±SD)表示,采用SPSS 17.0软件进行分析,三组之间用单向ANOVA,每两组之间采用LSD-t检验进行分析,以α=0.05为检验水准,明确CNV-Seq诊断异常的CN值的cut-off点：3.选择5份冻存的外周血,包含6个从0.56 Mb到5.78 Mb大小不同的CNVs(基因组水平CNV-Seq已经明确诊断)作为细胞来源,分别用五细胞和单细胞为底物进行WGA,并对其WGA产物进行不同水平的三次重复测序,统计结果,进一步探索CNV-Seq在细胞水平的分辨率；4.选择中国人民解放军总医院生殖中心的有PGT指针且同意纳入研究的7对夫妇的胚胎为观察对象,以CNV-Seq为主要诊断手段进行诊断,检测包括染色体非整倍体、非平衡易位和微小CNVs (< 10 Mb的重复和缺失),从而指导选择平衡胚胎进行移植。结果1.基因组水平在诊断6个CNVs时,CNV-Seq与aCGH诊断高度一致,同时异常区域上升和下降趋势显著,并且能够提供精确的位置信息。而用33pg稀释基因组和单细胞WGA产物后,CNV-Seq也成功检测到异常区域；2. CNV-Seq对6.52 Mb缺失和14.76 Mb复制的检测,在3次基因组水平和30次细胞水平的重复中,均成功地检测到异常区域。两个异常区域在基因组水平、五细胞水平和单细胞水平的CN值的Mean±SD分别1.01±0.03与2.96±0.03(基因组DNA),1.16±0.06与2.75±0.10(五细胞),和1.13±0.10与2.69±0.13(单细胞)。SPSS 17.0软件分析后,三组差异有统计学意义(p<0.05),五细胞和基因组水平的差异有统计学意义(p<0.05),单细胞和基因组水平的差异有统计学意义(p<0.05),但两个细胞水平之间的差异无统计学意义(p>0.05)：3.探索CNV-Seq在细胞水平的分辨率部分,针对6个从0.56 Mb到5.78 Mb大小不同的CNVs,分离单细胞和五细胞,每个水平和每个CNV分别重复3次,共36次目标观测检测,除4次0.56 Mb和1次2.32 Mb高度重复区域之外,其余异常区域成功检出；4. 在临床研究中,7对夫妇共有35个囊胚进行活检后的遗传学诊断,其中18个为染色体非整倍性改变,1个为非整倍体合并4.98 Mb缺失(5q35.2-qter deletion,与Sotos syndrome相关),1个为6.66 Mb缺失(7pter-p22.1 deletion,与7pterminal deletion syndrome相关),14个没有明确致病性的CNVs(可进行胚胎移植)和1个因为WGA扩增失败没有得到结果。其中7对夫妇中,有5对至少有1个可供移植的胚胎。结论1. CNV-Seq在诊断染色体疾病方面与aCGH有较高的一致性,且在细胞水平诊断有很好重复性和稳定性；2.成功构建了胚胎活检模型；3. CNV-Seq在细胞水平诊断异常时CN值cut-off点可能为2.6(>2.6为重复)和1.3(<1.3为缺失)；4. CNV-Seq有较高的分辨率(>1.5Mb)；5. CNV-Seq在PGT中有较强的诊断能力,涵盖对非整倍体、非平衡易位和微小CNVs (≤10 Mb)相关的染色体疾病,可尽可能减少致病性胚胎的移植。