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炎症反应和凝血之间的交叉活化(cross-talk)是目前急性肺损伤(ALI)和多器官功能障碍综合征(MODS)领域研究的热点,抗炎抗凝双向调节可能会给ALI和MODS的治疗带来积极而深远的影响。抗凝血酶-Ⅲ除了经典的抗凝作用外,近年来研究发现抗凝血酶-Ⅲ还具有较强的抗炎作用,提示抗凝血酶-Ⅲ具有抗炎抗凝双向调节作用,在ALI及MODS的临床治疗中有可能发挥更大潜力,已引起国内外学者广泛关注。本研究分别利用内毒素诱导和油酸诱导的急性肺损伤大鼠模型作为观察对象,观察抗凝血酶-Ⅲ对急性肺损伤的肺保护作用,探讨相关机制,为临床治疗急性肺损伤提供新的思路。
第一部分：抗凝血酶-Ⅲ对内毒素诱导急性肺损伤大鼠肺保护作用的研究。
目的：观察抗凝血酶-Ⅲ对内毒素诱导急性肺损伤大鼠的肺保护作用和对炎症反应的影响,探讨相关机制,为临床治疗急性肺损伤提供新的思路。
方法：60只清洁级雄性SD大鼠按随机数字法分为五组,分别为：⑴正常对照组;⑵急性肺损伤组;⑶抗凝血酶-Ⅲ治疗组;⑷抗凝血酶-Ⅲ合并肝素治疗组;(5)肝素治疗组。内毒素(6mg/kg)静脉注射建立急性肺损伤大鼠模型。HE染色观察肺组织病理改变,Smith肺损伤病理评分法评价肺损伤程度。采用发色底物法测定血浆中抗凝血酶-Ⅲ的活性。单核素示踪技术测定肺微血管白蛋白通透性(Palb)。比重法测定肺组织血管外肺水(EVLW)和肺组织湿/干重比(W/D)。酶联免疫吸附法(ELISA)测定血浆中TNF-α、IL-6和血管假性血友病因子(vWF)的含量。Western blotting检测肺组织丝裂原活化蛋白激酶(ERK1/2、P38和JNK MAPK)磷酸化蛋白表达。
结果：①与急性肺损伤组比较,抗凝血酶-Ⅲ治疗组和肝素治疗组大鼠肺组织病理损伤明显减轻,抗凝血酶-Ⅲ治疗组和肝素治疗组Smith肺损伤病理评分分别为4.33±1.21和5.00±1.26,显著低于急性肺损伤组8.00±1.09,尸均＜0.01。②急性肺损伤组血浆中抗凝血酶-Ⅲ的活性为76±8％,显著低于正常对照组(96±11％,P＜0.05)和抗凝血酶-Ⅲ治疗组(105±17％,P＜0.05)。③急性肺损伤组Palb为0.38±0.04,显著高于正常对照组(0.20±0.02,P＜0.01)、抗凝血酶-Ⅲ治疗组(0.30±0.04,P＜0.01)和肝素治疗组(0.28±0.04,P＜0.01)。急性肺损伤组与抗凝血酶-Ⅲ合并肝素治疗组两组之间Palb比较差异无显著性。④急性肺损伤组EVLW为0.806±0.069 ml/kg,显著高于抗凝血酶-Ⅲ治疗组(0.756±0.048 ml/kg,P＜0.01)和肝素治疗组(0.740±0.044 ml/kg,P＜0.01)。急性肺损伤组与抗凝血酶-Ⅲ合并肝素治疗组两组之间EVLW比较差异无显著性。⑤急性肺损伤组TNF-α和IL-6的含量分别为2.770±0.373μg/1和1.615±0.128 ng/ml,显著高于正常对照组(0.506±0.093μg/1和0.233±0.047 ng/ml,P均＜0.01)、抗凝血酶-Ⅲ治疗组(1.774±0.218μg/1和1.140±0.145 ng/ml,P均＜0.01)和肝素治疗组(1.924±0.349μg/l和1.223±0.127 ng/ml P均＜0.01)。⑥急性肺损伤组血浆中vWF的含量为31.78±7.51％,显著高于正常对照组(14.05±3.02％,P＜0.01)、抗凝血酶-Ⅲ治疗组(22.9±4.09％,P＜0.01)和肝素治疗组(24.88±3.99,P＜0.01)。⑦急性肺损伤组肺组织ERK1/2、P38 MAPK的磷酸化表达明显高于正常对照组、抗凝血酶-Ⅲ治疗组和肝素治疗组。急性肺损伤组与抗凝血酶-Ⅲ合并肝素治疗组两组之间肺组织ERK1/2、P38 MAPK的磷酸化表达无明显差异。各组间JNK MAPK磷酸化表达无明显差异。
结论：抗凝血酶-Ⅲ明显抑制细胞内信号转导蛋白ERK1/2、P38 MAPK的磷酸化表达,下调炎症介质TNF-α和IL-6的水平,减少肺微血管白蛋白通透性,对内毒素血症介导的急性肺损伤有显著的肺保护作用。单独应用抗凝血酶-Ⅲ,而不是抗凝血酶-Ⅲ合并肝素,可能对急性肺损伤和脓毒症患者有积极的保护作用。
第二部分：抗凝血酶-Ⅲ对油酸诱导急性肺损伤大鼠的肺保护作用。
目的：观察抗凝血酶-Ⅲ对油酸诱导急性肺损伤大鼠的肺保护作用,并探讨相关机制,为临床治疗急性肺损伤提供实验依据。
方法：60只清洁级雄性SD大鼠按随机数字法分为五组,分别为：⑴正常对照组;⑵急性肺损伤组;⑶抗凝血酶-Ⅲ治疗组;⑷抗凝血酶-Ⅲ合并肝素治疗组;⑸肝素治疗组。油酸(0.2ml/Kg)静脉注射建立急性肺损伤大鼠模型。HE染色观察肺组织病理改变,Smith肺损伤病理评分法评价肺损伤程度。发色底物法测定血浆中抗凝血酶-Ⅲ的活性。比重法测定肺组织血管外肺水(EVLW)和肺组织湿/干重比(W/D)。单核素示踪技术测定肺微血管白蛋白通透性(Palb)。酶联免疫吸附法(ELISA)测定血清中TNF-α、IL-6和血管假性血友病因子(vWF)的含量。Western blotting检测肺组织丝裂原活化蛋白激酶(ERK1/2、P38和JNK MAPK)磷酸化蛋白表达。
结果：①正常对照组Smith肺损伤病理评分为1.21±0.26,显著低于急性肺损伤组11.76±2.32、抗凝血酶-Ⅲ治疗组10.98±3.24、抗凝血酶-Ⅲ合并肝素治疗组12.07±1.83和肝素治疗组12.54±3.78(P均＜0.01)。急性肺损伤组Smith肺损伤病理评分与各治疗组比较无显著性差异。②各组间血浆抗凝血酶-Ⅲ的活性差异无显著性(P均＞0.05)。③急性肺损伤组Palb为0.50±0.07,显著高于正常对照组(0.20±0.02,P＜0.01),与抗凝血酶-Ⅲ治疗组(0.47±0.12)、抗凝血酶-Ⅲ合并肝素治疗组(0.47±0.08)和肝素治疗组(0.48±0.06)相比,差异均无显著性(P均＞0.05)。④急性肺损伤组EVLW为1.14±0.12,显著高于正常对照组(0.69±0.04,P＜0.01),与抗凝血酶-Ⅲ治疗组(1.12±0.21)、抗凝血酶-Ⅲ合并肝素治疗组(1.08±0.13)和肝素治疗组(1.14±0.20)相比,差异均无显著性(P均＞0.05)。⑤急性肺损伤组TNF-α和IL-6的含量分别为1.613±0.238μg/l和0.685±0.129ng/ml,显著高于正常对照组(0.506±0.093μg/l和0.233±0.047 ng/ml,P均＜0.01)、抗凝血酶-Ⅲ治疗组(0.972±0.287μg/l和0.476±0.097ng/ml,P均＜0.01)和肝素治疗组(0.952±0.122μg/1和0.465±0.103 ng/mlP均＜0.01)。⑥急性肺损伤组血浆中vWF的含量为32.48±4.84％,显著高于正常对照组(14.05±3.02％,P＜0.01),与抗凝血酶-Ⅲ治疗组(31.50±4.84)、抗凝血酶-Ⅲ合并肝素治疗组(32.26±9.19)和肝素治疗组(31.83±8.23)相比,差异均无显著性(P均＞0.05)。⑦急性肺损伤组肺组织ERK1/2、P38MAPK的磷酸化表达明显高于正常对照组,与抗凝血酶-Ⅲ治疗组、抗凝血酶-Ⅲ合并肝素治疗组和肝素治疗组相比,无明显差异。各组间JNK MAPK磷酸化表达无明显差异。
结论：抗凝血酶-Ⅲ虽降低血浆中TNF-α及IL-6表达,但对ERK1/2和P38MAPK磷酸化表达无明显的影响,未能明显减轻肺水肿和降低肺微血管白蛋白通透性,对油酸诱导ALI大鼠无明显的肺保护作用。