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甜菜夜蛾(5podoptera exiguaHubner)是一种世界范围内广泛分布的杂食性害虫,危害作物种类繁多。由于杀虫剂的大量使用,甜菜夜蛾已对多种传统杀虫剂产生了高度抗药性。氯虫苯甲酰胺是美国杜邦公司研发的新一代二酰胺类超高效杀虫剂,通过激活昆虫鱼尼丁受体,过度释放细胞内的钙离子,导致昆虫瘫痪抽搐,丧失行动能力,最终死亡。本文通过研究氯虫苯甲酰胺亚致死剂量LC25对甜菜夜蛾种群生长繁殖与解毒酶活性的影响,利用转录组测序分析了氯虫苯甲酰胺短期诱导对甜菜夜蛾体内解毒代谢酶相关基因表达的影响,筛选出经氯虫苯甲酰胺诱导显著上调表达的差异细胞色素P450基因,克隆其全长,通过RNA干扰解析其功能,揭示甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺适应过程中细胞色素P450s作用的分子机制,为进一步阐明甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺抗药性的分子机理及其有效治理提供理论依据。现将全文总结如下:采用饲料混毒法,测定氯虫苯甲酰胺对实验室敏感品系(SE-Lab品系)毒力,以及经氯虫苯甲酰胺亚致死剂量LC25连续汰选6代毒力(SE-Sel品系)的变化;采用两性生命表理论,通过记录试虫各年龄阶段生长、死亡、产卵量等数据,分析SE-Lab和SE-Sel品系的两性生命表参数差异。结果表明,SE-Sel品系成虫的产卵前期(APOP)和总产卵前期(TPOP)较SE-Lab品系变长,而产卵量减少,存活率降低;SE-Sel品系的内禀增长率(r)、周限增长率(λ)和净增殖率(R0)均显著小于SE-Lab品系,SE-Lab品系与SE-Sel 品系的 r分别为 0.18 和 0.16 d-1,λ 为 1.20 和 1.17 d-1 R0 358.42 和 203.12 d-1。SE-Sel品系的平均世代周期(T)与SE-Lab品系无显著差异。通过浸叶法测定磷酸三苯酯(TPP)、顺丁烯二酸二乙酯(DEM)、胡椒基丁醚(PBO)三种酶抑制剂与氯虫苯甲酰胺协同对SE-Lab和SE-Sel品系的毒力增效作用。试验前12 h让试虫取食浸渍过酶抑制剂的甘蓝叶片,对照组取食用0.1%TritonX-100浸溃后的叶片,再分别测定氯虫苯甲酰胺对使用酶抑制剂与未使用酶抑制剂试虫的毒力,结果表明,三种酶抑制剂中PBO增效作用最强,其对甜菜夜蛾SE-Sel品系和SE-Lab品系对氯虫苯甲酰胺的毒力增效比分别为1.58和1.69。进一步测定了试虫经氯虫苯甲酰胺亚致死剂量处理后,试虫中肠和脂肪体三种代谢解毒酶(羧酸酯酶(CarE)、谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)和多功能氧化酶(MFOs))活性的变化,结果表明,在氯虫苯甲酰胺亚致死剂量LC25连续汰选下,甜菜夜蛾体内三种解毒酶活性均被诱导上升,其中MFOs酶活力上升最显著,SE-Sel品系中肠和脂肪体的MFOs活性相对于SE-Lab品系分别提高了 2.07和2.10倍,而经氯虫苯甲酰胺亚致死剂量LC25再次诱导的SE-Sel试虫的MFOs活性亦较SE-Lab品系上升4.02和3.44倍;在使用酶抑制剂后,三种解毒酶活性均有下降,其中MFOs下降最多,其酶活性仅为未使用酶抑制剂处理的42.3%-44.8%。对SE-Lab品系和SE-Sel品系进行转录组测序,每个处理设置两个生物学重复。测序得到52756个甜菜夜蛾的Unigenes,有28488个基因得到注释;通过基因筛选(筛选条件为FDR<0.05且|log2FC|>1),有2935个差异显著的基因,其中有2306个基因显著下调,有629个基因显著上调。差异基因分别被分为3大类,细胞组分(Cellular Component)、分子功能(MolecularFunction)及生物学过程(BiologicalProcess)。转录组数据分析发现细胞色素P450基因的上调表达是甜菜夜蛾对氯虫苯甲酿胺抗性产生的重要因素之一。通过荧光定量PCR验证转录组数据中上调表达的细胞色素P450基因,筛选出10个经氯虫苯甲酰胺诱导后上调表达的细胞色素P450基因,再测定筛选后的10个细胞色素P450基因在田间种群SE-PZ(较SE-Lab品系氯虫苯甲酰胺抗性倍数为184.0)与SE-ZY(较SE-Lab品系氯虫苯甲酰胺抗性倍数为507.4)的表达量。最终确定4个与氯虫苯甲酰胺抗性相关的细胞色素P450基因Unigene0033153、Unigene0033605、Unigene0035508、Unigene0034612,四个基因均属于细胞色素 CYP9家族。Unigene0035508基因在SE-Sel与SE-ZY中的表达量较SE-Lab品系均上调8.5倍。通过向SE-ZY种群试虫滴喂dsRNA,沉默Unigene0035508基因,基因在12 h的干扰效果最好,相对表达量较对照组降低了 91.7%,在干扰后使用SE-ZY种群对氯虫苯甲酰胺的致死中浓度(LC50:16.744 μg/g)处理试虫,在24 h后,干扰组试虫较对照组死亡率有一定程度上升,但在48 h时两个处理间死亡率差异不显著。综上所述,氯虫苯甲酰胺亚致死剂量对甜菜夜蛾在短期内有持续控制作用,氯虫苯甲酰胺抗性的产生与其长期持续的使用有关。MFOs可能是参与甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺解毒代谢过程的主要解毒酶,与MFOs相关的编码基因(Unigene0035508)可能与甜菜夜蛾对氯虫苯甲酰胺抗性产生有关。