乙型脑炎（简称乙脑）是由乙型脑炎病毒（Japanese encephalitis virus,JEV）感染引起的一种虫媒性人兽共患传染病。该病可导致人的致死性脑炎,致死率可高达30%,即使幸存者,也有近50%的几率出现神经性后遗症;同时,该病可导致种猪的繁殖障碍,主要引起妊娠母猪流产、产死胎,公猪睾丸炎、精液品质下降等,严重危害养猪业。目前市售的猪用乙脑疫苗为减毒活疫苗,存在毒力反强的潜在风险,因此开发更加安全的乙脑新型疫苗具有重要意义。NS1是乙脑病毒的一个重要非结构蛋白,能够诱导体液和细胞介导的免疫反应,并通过可溶性补体结合活性来诱导交叉保护,可有效避免抗体依赖性增强（ADE）效应。本研究旨通过表达乙脑病毒NS1蛋白,制备亚单位疫苗,并在动物模型上评价其免疫效果。具体内容如下:1.乙脑病毒NS1蛋白的表达及纯化增殖乙脑病毒广西株（GX1209株）,提取RNA,利用RT-PCR方法扩增NS1基因。将NS1基因插入到慢病毒表达载体,利用共转染和药物筛选构建了稳定表达NS1蛋白的293T细胞系。通过镍柱亲和纯化方法对重组NS1蛋白进行纯化,结果发现,NS1蛋白在293T细胞系中表达量较低,不能满足亚单位疫苗制备的要求。为了获得大量NS1蛋白,本研究进而尝试杆状病毒表达系统。将NS1基因克隆至杆状病毒表达载体,构建重组杆粒r Bacmid-JEV-NS1,之后将重组杆粒转染至sf9细胞,通过Western Blot和IFA验证重组杆状病毒构建成功。将该重组杆状病毒感染High5细胞,收取培养基进行镍柱亲和蛋白纯化,并通过SDS-PAGE及Western Blot验证NS1蛋白纯化效果。结果表明,NS1蛋白在杆状病毒表达系统中获得了大量表达,并可分泌到培养基上清中。2.乙脑病毒灭活疫苗与亚单位疫苗制备为了比较乙脑病毒NS1亚单位疫苗与灭活疫苗的免疫效果,本研究首先需要制备乙脑灭活疫苗。即通过摸索ST细胞悬浮培养条件,建立了利用悬浮培养ST细胞大量增殖乙脑病毒GX毒株的工艺参数;然后,利用大量增殖的乙脑病毒GX毒株,采用β-丙内酯灭活后,添加VG201佐剂制备了JEV GX灭活苗。其次,将上述纯化的NS1蛋白与弗式佐剂配合,制成了NS1亚单位疫苗。3.乙脑病毒NS1蛋白亚单位疫苗免疫保护效果评价利用小鼠模型评价乙脑病毒NS1蛋白亚单位疫苗的免疫保护效果。首先,将四周龄C57BL/6雌性小鼠分为六组:PBS对照组、商品化弱毒疫苗组、灭活苗组以及NS1蛋白亚单位疫苗组（50μg/只免疫剂量组、100μg/只免疫剂量组、200μg/只免疫剂量组）,通过颈部皮下注射的方式对小鼠进行免疫。其中,弱毒疫苗组仅免疫一次,其他组均每两周免疫1次,共免疫两次。其次,在一免及二免后采血通过ELISA试验检测血清中NS1蛋白的抗体滴度,结果显示,除PBS组外,其他各组都产生了NS1抗体,且NS1抗体水平和NS1蛋白剂量呈正相关。二免14 d后,利用乙脑病毒P3毒株对小鼠进行了攻毒。在攻毒后第七天,PBS组出现精神沉郁、全身震颤等临床症状。此时,检测各组小鼠脑组织中的病毒载量和炎性因子水平,结果显示,PBS组小鼠脑组织内出现大量的乙脑病毒,炎性因子表达显著上升,而疫苗免疫的小鼠脑组织内几乎检测不到乙脑病毒,炎性因子的表达水平也显著低于PBS组。之后对脑组织进行HE和IHC染色,结果显示,疫苗免疫组与PBS组相比,小鼠脑组织的病理变化明显减轻。攻毒保护试验的结果显示,乙脑NS1蛋白亚单位疫苗对小鼠的保护效率可达到90%,而乙脑灭活苗和商品化弱毒苗的保护率达到100%。综上,本研究利用杆状病毒表达系统获得了乙脑病毒NS1蛋白,并制备了该蛋白的亚单位疫苗,通过小鼠免疫试验,证实了乙脑病毒NS1蛋白亚单位疫苗具有较好的免疫保护效果,具有开发为乙脑病毒新型疫苗的潜力。