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研究背景与目的: 小电导Ca2+激活K+通道（Small-conductance calcium-activated potassium channel，SK channel）是通过细胞内Ca2+激活的K+通道，表达在几乎所有可兴奋细胞。SK2通道是哺乳动物细胞中一种非电压依赖性钾通道，对细胞内 Ca2+浓度的改变具有很强的亲合性，当胞浆中的Ca2+浓度升高时，通过 Ca2+与钙调蛋白连接诱导构象改变，S K通道激活，K+外流，参与心肌细胞动作电位复极化过程，尤其发生于动作电位复极晚期，此期相当于心肌细胞兴奋性的相对不应期和超常期，而临床发生的心律失常多见于这一时期。因此 SK2通道对动作电位时程和构成起关键作用。SK2通道表达异常可引起心肌功能的变化，可能是导致或者诱发房颤、心房扑动等心律失常的机制之一，因此研究 SK2通道分子调控具有十分重要的意义。 耦联膜复合体（junctional membrane complexs,JMCs）位于细胞膜（PM）表面与内（肌）质网（SR/ER）之间，是实现可兴奋细胞有效功能交通的结构基础。Junctophilins（JPs，JPHs）是近年来发现的参与形成耦联膜复合体重要蛋白分子，其包含有JMC特性，通过使细胞膜与内（肌）质网膜之间保持较固定的距离而使JMC稳定。Junctophilin2位于心肌细胞偶联膜复合体中，是一种膜结合蛋白，它同时作用于细胞膜和内（肌）质网膜，使两者达到相当近距离，可维持 Ca2+稳态，实现心肌细胞钙诱导钙释放过程（calcium-induced calcium release,CICR），在心肌细胞兴奋-收缩耦联正常运转过程中起到至关重要的作用。在肥厚性心肌病和心力衰竭等心脏疾病中显示有JPH2蛋白表达水平的下调，可引起心肌细胞钙致钙释放过程减弱，兴奋-收缩失耦联。已有研究阐明Junctophilin与膜表面离子通道耦联具有重要意义，其表达异常成为相关疾病发生的病理机制之一。 本实验室之前的研究证实通过腺病毒介导的靶向小鼠JPH2基因的siRNA，可沉默小鼠心肌细胞JPH2蛋白的表达，有意义的是也可抑制细胞膜SK2通道的表达。为进一步研究JPH2蛋白与SK2通道的相互作用，本研究通过体外实验，建立HEK293细胞SK2通道表达细胞株、SK2通道和JPH2蛋白共表达细胞株及SK2通道和JPH2突变蛋白共表达细胞株，采用细胞直接裂解法和细胞表面生物素标记法，通过Western blot和细胞免疫荧光化学技术检测JPH2蛋白对SK2通道表达的影响，为探讨SK2通道与JPH2蛋白相互作用的分子机理奠定基础。 材料方法： 1.实验中分别构建pSK2-IRES-EGFP，pSK2-IRES-EGFP+JPH2和pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突变的重组质粒。 2.培养HEK293细胞并传代，参照脂质体Lip2000操作步骤，分别将构建的pSK2-IRES-EGFP质粒，pSK2-IRES-EGFP+JPH2质粒和pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突变质粒转染HEK293细胞，约48h后用荧光显微镜观察各质粒中绿色荧光蛋白EGFP的表达。 3.采用细胞直接裂解法和细胞表面生物素标记方法分别提取转染pSK2-IRES-EGFP质粒，pSK2-IRES-EGFP+JPH2质粒和pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突变质粒48h后HEK293细胞的总蛋白和膜蛋白,通过Western blot检测SK2通道的表达水平；Western blot结果用ImageJ软件做灰度分析后，数据通过统计学处理，用GraphPad Prism5进行统计分析学处理，不同组间SK2通道总蛋白和膜蛋白表达差异比较均采用两样本均数的t检验，以P<0.05为差异有显著性。 4.通过细胞免疫化学和荧光显微镜观察分别转染 pSK2-IRES-EGFP，pSK2-IRES-EGFP+JPH2质粒和pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突变质粒48h后SK2通道在HEK293细胞上的定位与亚细胞分布。 结果： 1.通过酶切和测序鉴定pSK2-IRES-EGFP，pSK2-IRES-EGFP+JPH2和pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突变重组质粒构建成功。 2.Western blot结果显示，采用细胞直接裂解法提取HEK293细胞总蛋白，细胞表面生物素标记方法提取 HEK293细胞膜蛋白。转染 pSK2-IRES-EGFP+JPH2质粒的HEK293细胞与转染pSK2-IRES-EGFP质粒的HEK293细胞相比，SK2通道总蛋白与膜蛋白表达量均有显著增加；而转染 pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突变质粒的HEK293细胞与转染pSK2-IRES-EGFP质粒的HEK293细胞相比，SK2通道的总蛋白与膜蛋白表达量均显著减少。 3.细胞免疫化学结果显示，转染 pSK2-IRES-EGFP质粒的HEK293细胞，其SK2通道主要分布于胞膜及胞质中；转染 pSK2-IRES-EGFP+JPH2质粒HEK293细胞，其 SK2通道明显分布于细胞膜；而 HEK293细胞转染pSK2-IRES-EGFP+JPH2101+141突变质粒后，SK2通道在细胞中表现出较弱的免疫阳性反应。 结论： JPH2蛋白可促进SK2通道在细胞膜上的表达和定位。