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研究背景
在已发现的癌症中，肺癌属于高死亡率的恶性肿瘤之一，该研究领域里，主要有非小细胞肺癌、小细胞肺癌，前者病例远比后者多，二者之比约为3:17。如果可以在早期进行诊断，手术切除后，一般病人可以获得较高的生存率。然而，大多数的患者在确诊肺癌时已经进入癌症晚期。尽管近年来肺癌的免疫学治疗、化疗、靶向药物治疗取得了重大进展，但化疗治疗依然是肺癌治疗的主要手段。然而研究表明，不管是免疫学治疗还是化疗都会引起耐药，所以在治疗过程中耐药是不可避免的。肺癌的临床治疗的手段和效果还有待提高，克服耐药依然是提高临床治疗效果有效的途径。所以对于肺癌的研究而言，提升肿瘤细胞的用药敏感性，是化学治疗最为关键的课题。
人类蛋白质二硫键异构酶(PDI)由21个成员组成，这些基因在长度、结构域排列和底物特异性方面各不相同。其包含了4个结构域，有惰性、活性之分，各有2个。其中在活性结构域中含有大量的半胱氨酸残基，每个PDI成员中的半胱氨酸活性位点是所有成员中最基本的结构域，主要是利用所具备的半胱氨酸和底物发生反应，进而产生二硫键，通过这种方式来发挥异构酶作用，可以纠正在蛋白折叠过程中错误二硫键的形成，起到帮助蛋白折叠的功能。所以PDI的主要功能是异构酶和分子伴侣。二硫键异构酶具有底物多样性的特点，二硫键异构酶与细胞的多种功能密切相关。
目前已经被证明部分PDI基因参与癌症的发生发展。例如PDIA1在多种癌症类型中普遍表达过高，包括脑癌、淋巴瘤、肾癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌。PDIA1参与肿瘤的转移和侵袭。AGR2在大多数腺癌中高表达，已经被证实是常见的促癌和转移因子。PDIA5影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。其他PDI成员在各种类型的癌症(包括转移性癌症)中也被上调。
由于PDI蛋白倾向于在黏液性组织中表达，其成员之一AGR2、PDIA1等促进肺癌的发生与侵袭转移。因为人体PDI家族有21个蛋白，不同的PDI成员在不同肿瘤中的表达是否具有选择性，是否与肿瘤的发生发展有关等尚缺乏研究。所以本论文以肺癌为模型，分析PDI家族成员在肺癌中的表达，确定与肺癌发生发展密切相关的PDI蛋白，并对其功能进行初步探讨。
研究内容
第一部分二硫键异构酶在肺癌组织中的表达分析
我们利用肺癌组织，对21个PDI基因的表达进行分析，再通过对应的数据，探究基因表达、病人预后之间的关联性，结果显示，二者有密切的联系。
1.PDIs基因在肺癌组织中的表达分析
第一步，针对21个肺癌与癌旁PDI基因水平进行检测分析，之后，通过Q-PCR，定量分析13个研究样品的mRNA的表达情况，结果显示，与癌旁组织相比，PDIA1、PDIA3、PDIA6、PDIA7、TMX1、TMX2、TMX3、TMX4、ERP46、AGR2和AGR3在肺癌组织中高表达。猜测它们可能参与肺癌的发生发展过程。
2.PDIs成员与肺癌预后的相关性分析
鉴于PDIs基因在肺癌组织中的表达情况，我们随后分析了它的家族成员和肺癌预后的相关性。通过对TCGA数据库中的数据进行分析，我们发现PDIA3、PDIA6、ERP27、TMX3、TMX4、ERP46、AGR3的高表达与肺癌的预后呈正相关。6个基因的表达水平和肺癌病人预后情况，具有负相关性。初步显示这些基因与肺癌的发生发展有关并显著改善肺癌的预后。
3.候选PDI成员在肺癌和癌旁组织的表达分析
根据PDI表达筛选、与肺癌预后相关性结果，我们从中选取4种候选基因PDIA2、PDIA3、PDIA6和TMX1进行蛋白水平的分析验证。因为PDIA3在肺癌中的作用已经被广泛研究，所以我们将PDIA3作为阳性对照。我们对样本进行蛋白水平的分析，通过免疫组化可以看出与癌旁组织相比，PDIA3、PDIA6和TMX1在肺癌组织中表达略高，PDIA2在肺癌组织和癌旁组织的表达无明显差异。蛋白印迹结果显示，与癌旁组织相比，PDIA3、PDIA6和TMX1在肺癌组织中表达高，PDIA2在肺癌组织中表达低。所以能够看出，对于肺癌的发生，PDIs成员具有多方面的影响。
4.非小细胞肺癌、小细胞肺癌中，候选PDI成员表达的不同
利用非小细胞肺癌细胞和小细胞肺癌细胞系，我们分析PDIA2、PDIA3、PDIA6和TMX1的表达情况，并以非肿瘤的肺支气管上皮细胞HBE、肺上皮细胞Base-2b作为阳性对照。分析发现，定量水平主要体现在其转录状态中，两类肺癌细胞对比来看，PDIA2、PDIA6和TMX1的表达在非小细胞肺癌里更高，而PDIA3的表达，两类细胞里都差不多，区别很小，不过H446细胞里，其表达水平却非常高。根据蛋白质印记来看，PDIA3、PDIA3、TMX1于非小细胞肺癌中的A549、H1299细胞里，水平最高，由此可以分析出，各类肺癌细胞里，PDIs成员所产生的影响，也不尽相同。
5.候选PDI成员在耐药细胞中的表达差异分析
之后我们对候选PDI蛋白所具备的影响进行了实验分析，选择H460、A549细胞和二者对应的多西紫杉醇耐药细胞;还有前列腺癌PC3细胞与其对应的多西他赛耐药细胞，观察其mRNA转录水平，结果发现，在PDIA3、PDIA6、TMX1里，其耐药株细胞水平更高。PDIA2在前列腺癌的耐药株中表达低，在肺癌细胞的耐药株中表达高。蛋白印迹中，PDIA2、TMX1和PDIA6的耐药株细胞水平也相对高，前列腺癌里，PDIA3耐药株水平相对低，不过其在肺癌细胞里，水平则要比正常细胞更高。
第二部分候选PDI成员在肺癌发生发展中的功能分析
根据候选PDI成员在肺癌组织和预后之间的关系、肺癌细胞以及耐药细胞的表达，我们将对这几个候选PDI成员进行功能分析。
1.上下调候选PDI基因的表达
为了进一步研究PDI的功能，根据前期实验数据分析，我们选取了PDI家族中的PDIA2、PDIA3和TMX1进行后续功能研究。在该研究里，目标对象是A549细胞、H1688细胞，选择这两个具有代表性的细胞，原因在于对非小细胞肺癌A549细胞而言，前者3种蛋白的水平都很高，对于小细胞肺癌H1688细胞而言，3种蛋白水平都低。我们通过转染携带干扰目的蛋白的RNA来下调A549细胞中蛋白的表达，同时在H1688细胞中分别转染PDIA2、PDIA3和TMX1的过表达质粒。
2.候选PDI成员影响肺癌细胞的生存
对携带干扰目的蛋白RNA进行转染，可让A549细胞里目的蛋白水平下降。利用细胞的MTT实验看出上下调候选PDI基因的表达影响肺癌细胞的生存。实验结果显示分别下调PDIA2、TMX1的表达促进肺癌肿瘤细胞的生存。下调PDIA3的表达抑制A549细胞的生存。此外，通过电子显微镜检测了si-PDIA2、si-PDIA3和si-TMX1未改变细胞的形态。通过免疫荧光可以看出敲低候选基因后在细胞中的定位未发生显著改变。所以在肿瘤细胞的发展变化里，候选PDI成员具有多个方面的影响。
3.肺癌治疗药物的选择
我们从两个方向选取了治疗肿瘤的药物，分别是化疗药物和蛋白酶体抑制剂。肿瘤化疗药物我们选取了多西紫杉醇、顺铂、阿霉素和vp16。蛋白酶体抑制剂选取的是靶向小分子硼替佐米。
4.PDIA2、PDIA3和TMX1影响肿瘤细胞的耐药
鉴于前期对于候选PDI成员在肺癌细胞和耐药细胞的表达有差异的研究，我们分析了PDIA2、PDIA3和TMX1是否可以调节肺癌细胞对肿瘤药物的敏感性。我们通过分别上下调PDIA2、PDIA3和TMX1基因的表达后用药物处理了这些稳定的细胞系。经过实验研究表明，分别下调PDIA2、PDIA3和TMX1的表达后抑制肺癌细胞对肿瘤化疗药物的敏感性，而分别上调PDIA2、PDIA3和TMX1的表达则促进了肺癌细胞对肿瘤药物的敏感性。对于蛋白酶体抑制剂，结果与疗药物相反。分别下调PDIA2、PDIA3和TMX1的表达后促进肺癌细胞对硼替佐米的敏感性，而分别上调PDIA2、PDIA3和TMX1的表达则抑制了肺癌细胞对硼替佐米的敏感性。
结论
1.PDI家族在肺癌中具有表达差异性，其中临床肺癌样本与相邻的非肿瘤癌旁组织相比，PDI家族中共有11种蛋白质有表达差异。
2.PDI家族的大部分蛋白可作为一种有效的生物标志物，并改善肺癌的预后。
3.小细胞肺癌、非小细胞肺癌中PDIA2、PDIA3、TMX1的表达差异
4.上下调候选PDI基因的表达影响肺癌细胞的生存
5.候选PDI家庭成员在耐药中起重要作用。PDIA2、PDIA3和TMX1的表达与肺癌细胞对化疗药物的敏感性呈正相关。PDIA2、PDIA3和TMX1的表达与肺癌细胞对药蛋白酶体抑制剂的敏感性呈负相关。
创新点与不足
1.创新点
(1)PDI蛋白家族在肿瘤中起重要的作用。目前已经探索了PDI家族在某些肿瘤细胞中表达增高，对于整个PDI蛋白家族在肺癌中的探索并未研究。PDI家族将成为一种新型的肿瘤靶向蛋白。
(2)分别敲低和过表达PDI家族成员中的PDIA2、PDIA3和TMX1参与肺癌细胞的耐药，为临床治疗中克服肿瘤的耐药提供新的解决办法。
2.不足点
(1)PDI家族影响耐药的机制尚未进行探索，可能与其中的二硫键异构酶有关，也可能与磷酸化等机制有关，需要进一步研究。
(2)缺少了动物模型，所以之后的检验没有完成，后续会继续进行完善。
在已发现的癌症中，肺癌属于高死亡率的恶性肿瘤之一，该研究领域里，主要有非小细胞肺癌、小细胞肺癌，前者病例远比后者多，二者之比约为3:17。如果可以在早期进行诊断，手术切除后，一般病人可以获得较高的生存率。然而，大多数的患者在确诊肺癌时已经进入癌症晚期。尽管近年来肺癌的免疫学治疗、化疗、靶向药物治疗取得了重大进展，但化疗治疗依然是肺癌治疗的主要手段。然而研究表明，不管是免疫学治疗还是化疗都会引起耐药，所以在治疗过程中耐药是不可避免的。肺癌的临床治疗的手段和效果还有待提高，克服耐药依然是提高临床治疗效果有效的途径。所以对于肺癌的研究而言，提升肿瘤细胞的用药敏感性，是化学治疗最为关键的课题。
人类蛋白质二硫键异构酶(PDI)由21个成员组成，这些基因在长度、结构域排列和底物特异性方面各不相同。其包含了4个结构域，有惰性、活性之分，各有2个。其中在活性结构域中含有大量的半胱氨酸残基，每个PDI成员中的半胱氨酸活性位点是所有成员中最基本的结构域，主要是利用所具备的半胱氨酸和底物发生反应，进而产生二硫键，通过这种方式来发挥异构酶作用，可以纠正在蛋白折叠过程中错误二硫键的形成，起到帮助蛋白折叠的功能。所以PDI的主要功能是异构酶和分子伴侣。二硫键异构酶具有底物多样性的特点，二硫键异构酶与细胞的多种功能密切相关。
目前已经被证明部分PDI基因参与癌症的发生发展。例如PDIA1在多种癌症类型中普遍表达过高，包括脑癌、淋巴瘤、肾癌、卵巢癌、前列腺癌和肺癌。PDIA1参与肿瘤的转移和侵袭。AGR2在大多数腺癌中高表达，已经被证实是常见的促癌和转移因子。PDIA5影响肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。其他PDI成员在各种类型的癌症(包括转移性癌症)中也被上调。
由于PDI蛋白倾向于在黏液性组织中表达，其成员之一AGR2、PDIA1等促进肺癌的发生与侵袭转移。因为人体PDI家族有21个蛋白，不同的PDI成员在不同肿瘤中的表达是否具有选择性，是否与肿瘤的发生发展有关等尚缺乏研究。所以本论文以肺癌为模型，分析PDI家族成员在肺癌中的表达，确定与肺癌发生发展密切相关的PDI蛋白，并对其功能进行初步探讨。
研究内容
第一部分二硫键异构酶在肺癌组织中的表达分析
我们利用肺癌组织，对21个PDI基因的表达进行分析，再通过对应的数据，探究基因表达、病人预后之间的关联性，结果显示，二者有密切的联系。
1.PDIs基因在肺癌组织中的表达分析
第一步，针对21个肺癌与癌旁PDI基因水平进行检测分析，之后，通过Q-PCR，定量分析13个研究样品的mRNA的表达情况，结果显示，与癌旁组织相比，PDIA1、PDIA3、PDIA6、PDIA7、TMX1、TMX2、TMX3、TMX4、ERP46、AGR2和AGR3在肺癌组织中高表达。猜测它们可能参与肺癌的发生发展过程。
2.PDIs成员与肺癌预后的相关性分析
鉴于PDIs基因在肺癌组织中的表达情况，我们随后分析了它的家族成员和肺癌预后的相关性。通过对TCGA数据库中的数据进行分析，我们发现PDIA3、PDIA6、ERP27、TMX3、TMX4、ERP46、AGR3的高表达与肺癌的预后呈正相关。6个基因的表达水平和肺癌病人预后情况，具有负相关性。初步显示这些基因与肺癌的发生发展有关并显著改善肺癌的预后。
3.候选PDI成员在肺癌和癌旁组织的表达分析
根据PDI表达筛选、与肺癌预后相关性结果，我们从中选取4种候选基因PDIA2、PDIA3、PDIA6和TMX1进行蛋白水平的分析验证。因为PDIA3在肺癌中的作用已经被广泛研究，所以我们将PDIA3作为阳性对照。我们对样本进行蛋白水平的分析，通过免疫组化可以看出与癌旁组织相比，PDIA3、PDIA6和TMX1在肺癌组织中表达略高，PDIA2在肺癌组织和癌旁组织的表达无明显差异。蛋白印迹结果显示，与癌旁组织相比，PDIA3、PDIA6和TMX1在肺癌组织中表达高，PDIA2在肺癌组织中表达低。所以能够看出，对于肺癌的发生，PDIs成员具有多方面的影响。
4.非小细胞肺癌、小细胞肺癌中，候选PDI成员表达的不同
利用非小细胞肺癌细胞和小细胞肺癌细胞系，我们分析PDIA2、PDIA3、PDIA6和TMX1的表达情况，并以非肿瘤的肺支气管上皮细胞HBE、肺上皮细胞Base-2b作为阳性对照。分析发现，定量水平主要体现在其转录状态中，两类肺癌细胞对比来看，PDIA2、PDIA6和TMX1的表达在非小细胞肺癌里更高，而PDIA3的表达，两类细胞里都差不多，区别很小，不过H446细胞里，其表达水平却非常高。根据蛋白质印记来看，PDIA3、PDIA3、TMX1于非小细胞肺癌中的A549、H1299细胞里，水平最高，由此可以分析出，各类肺癌细胞里，PDIs成员所产生的影响，也不尽相同。
5.候选PDI成员在耐药细胞中的表达差异分析
之后我们对候选PDI蛋白所具备的影响进行了实验分析，选择H460、A549细胞和二者对应的多西紫杉醇耐药细胞;还有前列腺癌PC3细胞与其对应的多西他赛耐药细胞，观察其mRNA转录水平，结果发现，在PDIA3、PDIA6、TMX1里，其耐药株细胞水平更高。PDIA2在前列腺癌的耐药株中表达低，在肺癌细胞的耐药株中表达高。蛋白印迹中，PDIA2、TMX1和PDIA6的耐药株细胞水平也相对高，前列腺癌里，PDIA3耐药株水平相对低，不过其在肺癌细胞里，水平则要比正常细胞更高。
第二部分候选PDI成员在肺癌发生发展中的功能分析
根据候选PDI成员在肺癌组织和预后之间的关系、肺癌细胞以及耐药细胞的表达，我们将对这几个候选PDI成员进行功能分析。
1.上下调候选PDI基因的表达
为了进一步研究PDI的功能，根据前期实验数据分析，我们选取了PDI家族中的PDIA2、PDIA3和TMX1进行后续功能研究。在该研究里，目标对象是A549细胞、H1688细胞，选择这两个具有代表性的细胞，原因在于对非小细胞肺癌A549细胞而言，前者3种蛋白的水平都很高，对于小细胞肺癌H1688细胞而言，3种蛋白水平都低。我们通过转染携带干扰目的蛋白的RNA来下调A549细胞中蛋白的表达，同时在H1688细胞中分别转染PDIA2、PDIA3和TMX1的过表达质粒。
2.候选PDI成员影响肺癌细胞的生存
对携带干扰目的蛋白RNA进行转染，可让A549细胞里目的蛋白水平下降。利用细胞的MTT实验看出上下调候选PDI基因的表达影响肺癌细胞的生存。实验结果显示分别下调PDIA2、TMX1的表达促进肺癌肿瘤细胞的生存。下调PDIA3的表达抑制A549细胞的生存。此外，通过电子显微镜检测了si-PDIA2、si-PDIA3和si-TMX1未改变细胞的形态。通过免疫荧光可以看出敲低候选基因后在细胞中的定位未发生显著改变。所以在肿瘤细胞的发展变化里，候选PDI成员具有多个方面的影响。
3.肺癌治疗药物的选择
我们从两个方向选取了治疗肿瘤的药物，分别是化疗药物和蛋白酶体抑制剂。肿瘤化疗药物我们选取了多西紫杉醇、顺铂、阿霉素和vp16。蛋白酶体抑制剂选取的是靶向小分子硼替佐米。
4.PDIA2、PDIA3和TMX1影响肿瘤细胞的耐药
鉴于前期对于候选PDI成员在肺癌细胞和耐药细胞的表达有差异的研究，我们分析了PDIA2、PDIA3和TMX1是否可以调节肺癌细胞对肿瘤药物的敏感性。我们通过分别上下调PDIA2、PDIA3和TMX1基因的表达后用药物处理了这些稳定的细胞系。经过实验研究表明，分别下调PDIA2、PDIA3和TMX1的表达后抑制肺癌细胞对肿瘤化疗药物的敏感性，而分别上调PDIA2、PDIA3和TMX1的表达则促进了肺癌细胞对肿瘤药物的敏感性。对于蛋白酶体抑制剂，结果与疗药物相反。分别下调PDIA2、PDIA3和TMX1的表达后促进肺癌细胞对硼替佐米的敏感性，而分别上调PDIA2、PDIA3和TMX1的表达则抑制了肺癌细胞对硼替佐米的敏感性。
结论
1.PDI家族在肺癌中具有表达差异性，其中临床肺癌样本与相邻的非肿瘤癌旁组织相比，PDI家族中共有11种蛋白质有表达差异。
2.PDI家族的大部分蛋白可作为一种有效的生物标志物，并改善肺癌的预后。
3.小细胞肺癌、非小细胞肺癌中PDIA2、PDIA3、TMX1的表达差异
4.上下调候选PDI基因的表达影响肺癌细胞的生存
5.候选PDI家庭成员在耐药中起重要作用。PDIA2、PDIA3和TMX1的表达与肺癌细胞对化疗药物的敏感性呈正相关。PDIA2、PDIA3和TMX1的表达与肺癌细胞对药蛋白酶体抑制剂的敏感性呈负相关。
创新点与不足
1.创新点
(1)PDI蛋白家族在肿瘤中起重要的作用。目前已经探索了PDI家族在某些肿瘤细胞中表达增高，对于整个PDI蛋白家族在肺癌中的探索并未研究。PDI家族将成为一种新型的肿瘤靶向蛋白。
(2)分别敲低和过表达PDI家族成员中的PDIA2、PDIA3和TMX1参与肺癌细胞的耐药，为临床治疗中克服肿瘤的耐药提供新的解决办法。
2.不足点
(1)PDI家族影响耐药的机制尚未进行探索，可能与其中的二硫键异构酶有关，也可能与磷酸化等机制有关，需要进一步研究。
(2)缺少了动物模型，所以之后的检验没有完成，后续会继续进行完善。