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H9N2禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)为低致病性AIV,在我国分布广泛,可感染家禽和野禽,给养禽业带来了巨大的经济损失。H9N2AIV可以直接感染人,或为H5和H7亚型AIV提供部分甚至整个内部基因盒,产生新型重组病毒,给公共卫生带来潜在威胁。现阶段我国的H9N2亚型禽流感防控策略主要是采用灭活疫苗免疫预防的方式,但灭活苗存在成本高,使用不方便,诱导的免疫应答单一,影响流行病学检测等缺陷,因此有必要研究更为方便、免疫效果更好的减毒活疫苗。但减毒活疫苗也存在与野生毒株发生重配的安全风险。因此,本研究在前期H9N2亚型AIVNS1缺失(保留1-128 aa)减毒株的基础上,通过互换H9N2亚型AIV的HA和NS1基因的包装信号,构建包装信号互换的减毒株,并对其免疫效力进行了评价。为进一步开发安全高效的H9N2亚型AIV减毒疫苗奠定了基础。1包装信号替换的H9N2亚型AIV拯救及其生物学特性测定为了降低减毒活疫苗与野生毒株发生重组的几率,对H9N2亚型(TX株)HA和NS1-128基因开放阅读框(Open reading frame,ORF)中片段自身的包装信号区域进行同义突变,并将ATG和剪切位点突变后进行互换,构建了互换HA和NS1缺失基因包装信号的反向遗传质粒。双替换入TX株骨架,应用反向遗传重组技术成功获得拯救病毒rTX-NS1-128(mut),单替换病毒无法拯救。重组病毒rTX-NS1-128(mut)的HA效价为6 log2,在SPF鸡胚中复制良好,滴度可达7.83±0.35 Log10EID50/0.1 mL,但在MDCK细胞中的复制效率显著低于野生病毒。重组病毒在SPF鸡胚中连续传代20代,测序验证具有较好的遗传稳定性。rTX-NS1-128(mut)与NS1基因缺失病毒rTX-NS1-128或野生型TX毒株以MOI=10共感染MDCK细胞,对共感染细胞上清进行空斑纯化,测定各自重组的概率,鉴定结果表明,rTX-NS1-128(mut)不能与母本毒株或野生型毒株发生HA和NS片段的独立重配。以上结果表明,互换包装信号的NS1基因缺失H9N2致弱病毒构建成功,为下一步研究奠定基础。2互换包装信号的NS1基因缺失H9N2亚型重组AIV(rTX-NS1-128(mut))的免疫效力评价为了评价替换包装信号的H9N2亚型重组AIV作为减毒疫苗候选株的潜力,开展了鸡的致病性试验、传播试验和免疫保护效力试验。将重组病毒以106 EID50剂量滴鼻点眼免疫4周龄SPF鸡,于3、5 d检测气管和肺脏载毒量情况,并采集3、5、7 d喉头和泄殖腔棉拭进行病毒分离。结果显示载毒量和排毒水平与NS1基因缺失病毒相似,均表现出减毒特性;HI抗体测定结果显示,接种后3周HI达到顶峰,平均可达7.89±0.87 log2,免疫后11周还可达3.85±0.25 log2;接触传播试验结果显示,重组病毒完全失去了接触传播的能力;黏膜免疫和细胞免疫检测结果显示,与灭活病毒相比,重组毒可以诱导更高水平的黏膜免疫和细胞免疫;免疫21 d后对鸡只进行攻毒,结果显示,针对同源H9N2亚型AIV(TX株)攻击,可提供100%保护率,针对异源F98株的攻击,可提供80%的保护率。上述结果表明rTX-NS1-128(mut)与rTX-NS1-128组在鸡的致病性、传播特性和免疫保护效力较为一致,rTX-NS1-128(mut)可作为更为安全的减毒疫苗候选株。3鉴别NS1基因缺失H9N2病毒与野毒株的实时荧光定量定量PCR检测方法的建立为了区别疫苗免疫株和野生型毒株感染,本研究建立了一种鉴别互换包装信号的NS1基因缺失H9N2病毒rTX-NS1-128(mut)与野毒株的核酸检测方法。分别设计针对AIVM基因和NS1基因缺失区域的特异性qRT-PCR引物。成功构建了标准品质粒,绘制了标准曲线;特异性结果显示,该方法可以鉴别出多种HA亚型AIV野毒株的M和NS基因;而针对疫苗候选株rTX-NS1-128(mut),仅能扩增M基因,无法扩增NS基因(Ct值>35);灵敏性试验结果表明,该方法可以检测到1000～100 EID50/μL的H5、H7和H9亚型AIV;对棉拭子样品检测结果显示,该方法与病毒分离的检出率基本一致。表明该检测方法,是一种特异,灵敏的可鉴别NS1基因缺失病毒与野生型病毒的方法。