随着社会发展和工业化进程的不断推进,大气污染日益严重,并且已经成为威胁人类健康的主要因素之一,越来越受到社会各界的广泛关注。大气污染中可吸入细颗粒物(PM2.5,即空气动力学直径≤2.5μm细小颗粒物)由于表面积巨大,易吸附大量浓缩的有毒物质,对人类健康极具威胁。大量流行病学研究发现,长期暴露于环境中的PM2.5或者PM2.5浓度急剧升高时心血管疾病的发病率和病死率都会升高,可以推断PM2.5与心血管疾病的发生发展密切相关。由内皮细胞组成的血管内皮系统是血管中的血液及其成分与外界之间的重要屏障,对外来刺激以及毒性物质的侵袭具有重要的防御功能。有研究发现,血管内皮暴露于PM2.5后会引起氧化应激,进一步刺激产生过多的活性氧物质,后者损伤内皮细胞致使内皮功能障碍,外源毒物入侵,导致各种疾病的发生。并且报道称在PM2.5引起内皮细胞氧化应激的早期机体会通过自身保护机制,激活转录因子核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶-1(HO-1)抗氧化途径以中和活性氧物质。可见内皮细胞的重要性非同一般,因此,本课题选取人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为研究对象,观察PM2.5对HUVEC细胞的毒性作用。绿茶是人们日常生活中最流行饮品之一,绿茶中茶多酚的主要成分表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)是一种强效的抗氧化剂,通过清除自由基而发挥抗氧化、抗衰老、抗癌等保护作用。相关研究发现,EGCG是通过激活Nrf2/HO-1通路而发挥抗氧化功能的。因此,本研究的目的是观察EGCG是否能通过激活Nrf2/HO-1通路抑制PM2.5所介导的HUVEC氧化应激损伤,并进一步研究其分子机制和信号通路。结果显示:200μg/ml的PM2.5显著增加细胞死亡率和细胞内ROS水平,而50~400μM的EGCG以浓度依赖性的方式降低细胞内ROS水平,抑制细胞死亡率;为探明其分子机制,我们采用Western blot和Real-time PCR等分子生物学技术,发现PM2.5可以使HUVEC细胞中Nrf2和HO-1的表达减少,而EGCG可以逆转此作用;同时,我们选用MAPK通路阻断剂,观察EGCG保护作用的信号通路。其中,PD98059(胞外信号调节激酶[ERK1/2]的选择性抑制剂)和SB203580(p38 MAPK蛋白的选择性抑制剂),不仅可以抑制EGCG诱导的Nrf2和HO-1的表达增加,而且可以使EGCG降低活性氧和提高细胞生存率的作用消失,但SP600125(c-jun氨基末端激酶[JNK]的选择性抑制剂)无此效应。此外,为了明确Nrf2在EGCG发挥抗氧化保护作用中的关键作用,我们采用基因沉默技术,人为降低Nrf2的表达后EGCG上调细胞内HO-1蛋白表达、降低活性氧以及提高细胞生存率的效应消失。综上所述,当HUVEC细胞暴露于PM2.5时,EGCG可能通过活化p38 MAPK和ERK1/2信号途径,上调Nrf2介导的HO-1表达,降低活性氧的产生,提高细胞存活率,从而防止心血管疾病的发生发展。第一部分EGCG在PM2.5所致HUVEC细胞损伤中的作用目的:本部分研究通过大气细颗粒物PM2.5水溶成分对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)进行干预,观察EGCG对PM2.5所致的HUVEC损伤的影响。方法:1.细胞株人脐静脉内皮细胞细胞株:购自中国科学院上海细胞库。2.试验方法 2.1 PM2.5水溶成分的提取2.2 HUVEC细胞培养选用高糖型DMEM培养基+10%胎牛血清+1%青链霉素混合液为细胞培养基,于37℃,含5%CO2和95%空气的培养箱中进行培养,待细胞融合度达80%以上即可进行传代。2.3检测指标2.3.1检测HUVEC细胞存活率(细胞计数Kit-8法)2.3.2检测HUVEC细胞内活性氧水平(DCFH2-DA探针标记流式细胞术分析和激光共聚焦显微镜)结果:1.EGCG对HUVEC细胞存活率的影响取50~200μM的EGCG作用于HUVEC细胞,24小时后观察细胞存活率,结果显示300和400μM的EGCG显著减少细胞存活率。因此,选择浓度为50~200μM的EGCG用于后续实验。2.PM2.5作用于HUVEC细胞后细胞存活率下降取50~400μg/ml的PM2.5作用于HUVEC 24小时,浓度依赖性的使细胞存活率下降,并且计算出IC50值是200μg/ml。3.EGCG预处理后逆转PM2.5对于HUVEC细胞的损伤取50~400μM的EGCG预孵育HUVEC 30min后,用200μg/ml的PM2.5对细胞进行干预,24小时后结果显示EGCG浓度依赖性方式逆转细胞存活率下降。并且100μM和200μM的EGCG几乎完全抵消了PM2.5所致细胞存活力降低。4.EGCG预处理后减少PM2.5所致HUVEC细胞内ROS的生成取100μM的EGCG预孵育HUVEC 30min后,用200μg/ml的PM2.5对细胞进行干预,24小时后结果显示PM2.5处理组ROS产生明显升高,而EGCG可以完全逆转PM2.5所致细胞内ROS的升高。结论:1.200μg/ml的PM2.5作用于HUVEC后,细胞存活率明显降低并且细胞内ROS显著升高。2.100μM的EGCG完全逆转PM2.5所致细胞存活率的下降和细胞内ROS的升高。第二部分EGCG在PM2.5所致HUVEC细胞损伤中保护作用的分子机制目的:研究经EGCG预处理,大气细颗粒物PM2.5水溶成分作用于HUVEC细胞后Nrf2/HO-1表达以及MAPK阻断剂预处理以后Nrf2/HO-1表达水平的变化。方法:1.细胞株人脐静脉内皮细胞细胞株:购自中国科学院上海细胞库。2.试验方法 2.1 HUVEC细胞培养选用高糖型DMEM培养基+10%胎牛血清+1%青链霉素混合液为细胞培养基,于37℃,5%CO2和95%空气的培养箱中进行培养,待细胞融合度达80%以上即可进行传代。3.检测指标3.1检测HUVEC细胞存活率(细胞计数Kit-8法)3.2检测HUVEC细胞内活性氧水平(DCFH2-DA探针标记流式细胞术分析和激光共聚焦显微镜)3.3检测HUVEC细胞内Nrf2/HO-1的蛋白表达(Western blot)3.4检测HUVEC细胞内Nrf2/HO-1的m RNA表达(Real-time PCR)结果:1.PM2.5作用于HUVEC后细胞内Nrf2和HO-1表达下降取50~400μg/ml的PM2.5作用于HUVEC 24小时,结果显示50和100μg/ml浓度的PM2.5使细胞内Nrf2/HO-1上升,而200、300、400μg/ml的PM2.5使细胞内Nrf2和HO-1急剧下降。2.EGCG预处理后逆转PM2.5所致HUVEC细胞内Nrf2和HO-1表达下降取50~400μM的EGCG预孵育HUVEC细胞30min后,用200μg/ml的PM2.5对细胞进行干预,24小时后结果显示EGCG浓度依赖性方式逆转使细胞内Nrf2和HO-1下降。3.MAPK阻断剂对EGCG预处理后PM2.5所致HUVEC细胞存活率的影响取MAPK三种阻断剂PD98059,SP600125,SB203580对HUVEC细胞进行预处理,30min后用100μM的EGCG干预,最后用200μg/ml的PM2.5对HUVEC细胞进行处理,结果显示PD98059和SB203580可以完全阻断EGCG升高细胞存活率的作用,而SP600125却无此作用。4.MAPK阻断剂对EGCG预处理后PM2.5所致HUVEC细胞内ROS的影响取MAPK三种阻断剂PD98059,SP600125,SB203580对HUVEC细胞进行预处理,30min后用100μM的EGCG干预,最后用200μg/ml的PM2.5对细胞进行处理,结果显示PD98059和SB203580可以完全阻断EGCG降低HUVEC细胞内ROS的产生,而SP600125却无此作用。5.MAPK阻断剂对EGCG预处理后PM2.5所致HUVEC细胞内Nrf2和HO-1表达的影响取MAPK三种阻断剂PD98059,SP600125,SB203580对HUVEC细胞进行预处理,30min后用100μM的EGCG干预,最后用200μg/ml的PM2.5对细胞进行处理,结果显示PD98059和SB203580可以完全阻断EGCG升高HUVEC细胞内Nrf2和HO-1的作用,而SP600125却无此作用。讨论:1.PM2.5使HUVEC细胞内Nrf2/HO-1表达下降,而EGCG完全逆转该效应。2.EGCG对PM2.5所致的细胞损伤的保护作用可能是通过ERK1/2和p38MAPK而不是JNK途径实现的。第三部分Nrf2基因在EGCG抗氧化损伤作用中的关键性作用目的:研究在Nrf2基因沉默基础上,给与EGCG进行预处理和PM2.5作用后HUVEC细胞内Nrf2/HO-1表达水平的变化。方法:1.细胞株人脐静脉内皮细胞细胞株:购自中国科学院上海细胞库。2.试验方法 2.1 HUVEC细胞培养选用高糖型DMEM培养基+10%胎牛血清+1%青链霉素混合液为细胞培养基,于37℃,5%CO2和95%空气的培养箱中进行培养,待细胞融合度达80%以上即可进行传代。2.2构建Nrf2基因沉默质粒转染HUVEC细胞3.检测指标3.1检测HUVEC细胞存活率(细胞计数Kit-8法)3.2检测HUVEC细胞内活性氧水平(DCFH2-DA探针标记流式细胞术分析和激光共聚焦显微镜)3.3检测HUVEC细胞内Nrf2/HO-1的蛋白表达(Western blot)结果:1.Nrf2 RNA干扰质粒Nrf2-sh RNA构建成功用构建好的Nrf2-sh RNA质粒转染HUVEC细胞,检测细胞内Nrf2表达发现:与正常细胞相比较Nrf2蛋白及m RNA的表达降低约50%,说明质粒构建和细胞转染成功。2.PM2.5作用于Nrf2-sh RNA干扰的HUVEC细胞后EGCG升高细胞存活率的效应消失EGCG分别预孵育Nrf2-sh RNA干扰的HUVEC细胞和正常HUVEC细胞30min后,用200μg/ml的PM2.5对细胞进行干预,结果显示Nrf2-sh RNA干扰明显降低细胞存活率。3.PM2.5作用于Nrf2-sh RNA干扰的HUVEC细胞后EGCG降低细胞内ROS的效应消失EGCG分别预孵育Nrf2-sh RNA干扰的HUVEC细胞和正常HUVEC细胞30min后,用200μg/ml的PM2.5对细胞进行干预,结果显示Nrf2-sh RNA干扰明显增加细胞内ROS的产生。4.PM2.5作用于Nrf2-sh RNA干扰的HUVEC细胞后EGCG升高Nrf2/HO-1蛋白表达的效应消失EGCG分别预孵育Nrf2-sh RNA干扰的HUVEC细胞和正常HUVEC细胞30min后,用200μg/ml的PM2.5对细胞进行干预,结果显示Nrf2-sh RNA干扰明显降低Nrf2和HO-1蛋白表达。讨论:EGCG对PM2.5所致HUVEC细胞损伤的保护作用主要是通过激活Nrf2途径,进一步增加细胞中HO-1的蛋白表达而发挥抗氧化作用的,使ROS产生减少,细胞存活率上升。