植物需求量最大的元素除了碳元素就是氮元素,氮是植物生长发育所必需的营养元素。因此农业生产中常常通过施加氮肥促进植物生长发育。但随着氮肥施加量日益增加,氮污染已成为当今人类面临的重大环境问题之一,因此研究植物对氮的吸收、运输和分配机制至关重要。硝酸盐是大多数植物的主要氮素来源,植物通过硝酸盐转运体吸收、运输和分配硝酸盐。前人研究表明多种土壤逆境如镉、钠和干旱等会通过激活植物激素乙烯/茉莉酸信号通路来调控硝酸盐转运体的表达,进而影响硝酸盐在植物各器官的分配,改变植物的生长发育和植物的耐逆性。同时大量研究也表明各种逆境均会激活丝分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)途径,但目前关于MAPK信号途径在逆境调控硝酸盐分配中的作用却并不清楚。随着臭氧层的破坏,紫外线B(UV-B)辐射增强亦成为当今人类面临的重大环境问题之一。前人研究表明UV-B辐射增强会抑制植物生长发育,激活MPK3/6以及丝分裂原活化蛋白激酶磷酸酶MKP1,也会促进乙烯生物合成限速酶ACC合酶(ACS)的基因表达和乙烯的生物合成,且MPK3/6介导了 UV-B辐射诱导ACS基因表达和乙烯生成。但目前关于UV-B辐射对植物硝酸盐分配的影响以及MAPK和乙烯信号途径在UV-B调控硝酸盐分配中的作用及其相互关系却并不清楚。基于以上现状,本文以拟南芥野生型Col-0和Ws以及功能缺失突变体mpk3-1、mpk6-1、mkp1、mkp1/mpk6和ein3-1为实验材料,借助基因表达分析、硝酸盐含量测定、蛋白激酶活性测定以及蛋白互作分析等方法,研究了 0.5 W.m-2 UV-B辐射对拟南芥硝酸盐分配的影响以及MKP1、MPK3/6和乙烯信号途径在UV-B调控硝酸盐分配中的作用及其分子机制,得到以下主要实验结果和结论:1.0.5 W.m-2 UV-B辐射3 h会促进拟南芥野生型Col-0和Ws地上部和根部ERF类转录因子ORA59、ERF1B和ERF104以及硝酸盐转运体NRT1.8的表达,抑制根部硝酸盐转运体NRT1.5的表达,提高硝酸盐的叶/茎和根/茎分配比。说明UV-B辐射通过调控硝酸盐转运体的表达影响了植物硝酸盐的分配。2.突变体ein3-1抑制了 UV-B辐射对拟南芥地上部和根部ERF类转录因子ORA59、ERF1B和ERF104以及硝酸盐转运体NRT1.8基因表达的促进作用,也抑制了 UV-B辐射对硝酸盐的叶/茎和根/茎分配比的促进作用,但不影响UV-B辐射对拟南芥根部硝酸盐转运体NRT1.5基因表达的抑制作用。说明UV-B辐射调控植物硝酸盐分配的信号转导过程中乙烯信号转导元件EIN3参与其中,其通过诱导ERF类转录因子ORA59、ERF1B和ERF104的表达进而促进硝酸盐转运体NRT1.8基因的表达;但EIN3并不参与UV-B辐射对硝酸盐转运体NRT1.5基因表达的抑制作用。3.UV-B辐射促进了拟南芥地上部MPK3和MPK6的活化,且其促进作用受MKP1负调控,但UV-B辐射并不影响拟南芥根部MPK3和MPK6的活性;突变体mpk3-1、mpk6-1和mkp1/mpk6抑制了 UV-B辐射对拟南芥地上部和根部ERF类转录因子ORA59、ERF1B和ERF104以及硝酸盐转运体NRT1.8基因表达的促进作用,也抑制了 UV-B辐射对硝酸盐的叶/茎和根/茎分配比的促进作用,但不影响UV-B辐射对拟南芥根部硝酸盐转运体NRT1.5基因表达的抑制作用;而突变体nkp1却增强了 UV-B辐射对拟南芥地上部和根部ERF类转录因子ORA59、ERF1B和ERF104以及硝酸盐转运体NRT1.8基因表达的促进作用,也增强了 UV-B辐射对硝酸盐的叶/茎和根/茎分配比的促进作用,但不影响UV-B辐射对拟南芥根部硝酸盐转运体NRT1.5基因表达的抑制作用。说明MKP1及其靶蛋白MPK3/6分别作为负调节因子和正调节因子参与了 UV-B辐射诱导ERF类转录因子ORA59、ERF1B和ERF1 04基因表达及其下游硝酸盐转运体NRT1.8基因表达的信号转导过程,且在该过程中MKP1的作用依赖于其对MPK3/6活性的调控;但MKP1及其靶蛋白MPK3/6并不参与UV-B辐射对硝酸盐转运体NRT1.5基因表达的抑制作用。4.通过酵母双杂交实验表明,MPK3与转录因子ORA59、ERF1B和ERF104存在直接互作,而MPK6只与ERF104直接互作。暗示UV-B辐射下,MPK3和MPK6不仅从转录水平调控ERF类转录因子的基因表达,也可能通过与转录因子的直接互作从转录后水平直接调控ERF类转录因子蛋白的稳定性。本实验室前期研究已表明MPK3/6介导了 UV-B辐射诱导的ACS基因表达和乙烯生成。综合本文实验结果和本实验室前期研究结果,我们得出UV-B辐射调控拟南芥硝酸盐分配的分子机制为:UV-B辐射活化拟南芥地上部MPK3和MPK6(该过程受MKP1负调控),活化的MPK3/6诱导地上部乙烯生物合成,并运输到根部促进根部乙烯水平增高,然后乙烯依赖于其信号转导元件EIN3诱导拟南芥地上部和根部ERF类转录因子ORA59、ERF1B和ERF104基因的表达,同时地上部活化的MPK3和MPK6也可通过与ERF类转录因子的互作直接调控其蛋白稳定型,之后ERF类转录因子ORA59、ERF1B和ERF104结合到硝酸盐转运体NRT1.8基因的启动子上直接诱导其表达,促进了 NRT1.8介导的硝酸盐从木质部向根部和叶片的卸载;另外,UV-B辐射通过不依赖于MPK3/6和乙烯信号途径的方式抑制根部硝酸盐转运体NRT1.5基因的表达,最终抑制了 NRT1.5介导的根部硝酸盐向木质部的装载,从而改变了硝酸盐在拟南芥各器官的分配。