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目的:研究α-1,6岩藻糖基转移酶(α-1,6 fucosyltransferase,FUT8)在TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞(Human kidney-2 ,HK-2)—肌成纤维细胞转分化(epithelial to mesenchymal transition, EMT)中的作用。方法:将体外培养的HK-2细胞随机分为三组:①(CON组)对照组常规培养;②(TGF组):加入浓分别为(5、10、20、40)ng/ml的TGF-β1刺激细胞;③(TGFF组):使用siRNA干扰技术沉默细胞的FUT8基因,随后再加入20ng/ml TGF-β刺激细胞。前期工作中,我们合成了荧光素标记的FUT8-siRNA并瞬时转染HK-2细胞,使用倒置荧光显微镜检测siRNA的转染效率;PT-PCR及FUT8免疫荧光技术分别检测FUT8-siRNA基因沉默效果及蛋白抑制率。刺激细胞72小时后,观察各组细胞形态学改变;分别使用western blot及免疫荧光技术检测细胞总FUT8蛋白及其底物α-1,6岩藻糖链的表达情况;此外使用免疫沉淀(Immunoprecipitation,IP)结合凝集素印迹检测特异性结合在TGF-βI/II型受体ALK-5(type I receptor activin-like kinase 5)及TGF-βRII(TGF-βtype II receptor)上的岩藻糖链的表达;使用免疫荧光技术共染FUT8、ALK5进一步验证两者的定位及表达;随后,使用western blot及免疫组化染色技术对P-smad2/3进行评估;而α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)也使用免疫组化染色进行评估。结果: RT-PCR及western blot检测结果显示FUT8-siRNA在100nM浓度下成功干扰HK-2细胞中FUT8基因及蛋白水平的表达,且转染效率达90%。使用相差显微镜观察CON组细胞呈正常地上皮细胞铺路石样形态;TGF组细胞发生明显的形态学改变,可见细胞肥大、拉长,提示发生成纤维化改变;而TGFF组可以一定程度的抑制TGF-β1诱导的HK-2细胞形态的改变。与CON组相比, TGF组FUT8总蛋白表达升高(P<0.05),而其底物岩藻糖链并无显著的变化(P>0.05);TGFF组与TGF组相比,FUT8蛋白(P<0.01)及其底物岩藻糖链(P<0.05)表达都降低。IP结合凝集素印迹显示特异性结合在TGF-βRII的岩藻糖链的表达情况,TGF组与CON组相比表达上调(P<0.05),而TGFF组与TGF组相比明显下调(P<0.01);以上变化趋势与ALK5结合的岩藻糖链的变化相同;并且使用荧光共聚焦显微镜进一步证实了ALK5与FUT8两者共表达,并且表达位点完全重合。TGF组呈剂量依赖性上调P-smad2/3表达(P<0.05);而TGFF组与TGF组比较,FUT8-siRNA可以阻断其上调(P<0.05);同样,α-SMA免疫组化结果显示TGF-β1可剂量依赖性上调其表达(P<0.05),而可以被FUT8-siRNA所阻断(P<0.05)。结论:1.FUT8-siRNA能够下调HK-2细胞ALK5、TGF-βRII的岩藻糖基化水平;2.抑制TGF-βRI、RII的岩藻糖基化修饰能够抑制其下游P-smad2/3活化,及其诱导的TEMT;3. ALK5、TGF-βRII的岩藻糖基化修饰可能是TGF-β1致肾间质纤维化的关键环节。