基于金纳米颗粒的酪氨酸酶活性分析方法研究

来源 :江南大学 | 被引量 : 1次 | 上传用户:zhangliu2009
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酪氨酸酶在动植物代谢中起着重要的作用,对其活性进行检测分析,不仅能为临床疾病诊断和治疗提供理论基础,也为阐明这些疾病的发病机理提供依据,同时在食品保鲜、环境检测等多个领域有重要意义。本论文建立了两种全新的利用功能化金纳米颗粒(AuNPs)对酪氨酸酶活性进行分析的方法,主要研究内容如下:论文首先确定了AuNPs的制备及修饰条件。利用柠檬酸三钠法合成AuNPs,采用离心法进行浓缩,离心条件是13000rpm、20min,用pH 7.0,1mM磷酸盐缓冲液(PBS)重悬获得分散均匀的浓缩AuNPs。在AuNPs表面自组装修饰16-巯基十六烷基酸(MHDA)后,利用缩合剂催化3-氨基苯基硼酸(APBA)共价连接到AuNPs表面,用此方法合成的功能化AuNPs(APBA/MHDA/AuNPs)在缓冲液中能均匀分散,其紫外-可见吸收光谱中AuNPs的特征吸收峰红移至530nm,并且在260nm附近有APBA的特征吸收峰。建立了一种光谱法对酪氨酸酶活性进行分析的方法,该方法利用酪氨酸酶催化底物酪氨酰酪氨酸(Tyr-Tyr)生成两端均带邻位羟基的桥联分子,该分子能介导APBA/MHDA/ AuNPs的聚集,根据随之产生的紫外-可见光谱的变化可以对酪氨酸酶的活性进行分析。酶活力分析反应条件为:反应体系为pH 6.5,50mM的PBS缓冲液,总体积0.1mL,底物浓度为5mM,25℃精确反应30min,80℃下终止酶活。往体系中加0.05mL 5mM的抗坏血酸,室温下反应15min将多巴醌还原为多巴。再加入0.1mL 9.5nM的功能化AuNPs,混合均匀后静置15min,测定紫外-可见吸收光谱,利用吸光度的变化与酶活性之间的关系进行酪氨酸酶活性的测定。透射电子显微镜观察证实了金胶溶液光谱变化是由于桥联分子使功能化AuNPs聚集引起的。该方法可检测反应体系中的酪氨酸酶活性的范围为10-10~10-8U/mL。建立了一种电化学法对酪氨酸酶活性进行分析的方法。该方法通过自组装和共价交联方式将酪胺基团修饰至金电极表面,再利用酪氨酸酶催化酪胺生成邻位羟基化合物多巴胺的反应,在电极表面结合被3-氨基苯基硼酸和单链DNA共同修饰的功能化AuNPs,而后利用[Ru(NH3)5Cl]2+作为探针检测电化学信号,从而对酪氨酸酶活性进行测定。确定酶活力分析条件为:反应体系为pH6.5,50mM的PBS缓冲液,25℃条件下进行反应。将电极浸于其中以使表面的酪胺基团被催化形成多巴醌,而后将电极浸于质量分数为0.7%的抗坏血酸溶液中反应30min使多巴醌被还原成多巴胺。再将电极浸入经ssDNA进一步修饰的APBA/MHDA/AuNPs中静置30min使DNA/APBA/MHDA/AuNPs共价交联在电极表面,而后引入[Ru(NH3)5Cl]2+作为探针进行电流信号的检测。利用循环伏安法测得的峰电流值与酪氨酸酶活性之间的关系,建立起酶活性的检测方法。该方法对酪氨酸酶活力检测的范围在10-14~10-10U/mL,具有极高的检测灵敏度和很宽的检测范围。
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