【摘 要】
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【目的】试验旨在对和田羊和卡拉库尔羊KAP11.1和KAP24.1基因进行克隆及表达,探索不同雄激素浓度对蛋白表达量的影响,并对两个基因在绵羊皮肤毛囊中表达量进行比较,为后续深入研究KAP基因功能以及对羊毛品质的影响提供理论基础。【方法】试验以三种绵羊体侧皮肤毛囊为研究材料,以Gen Bank中绵羊KAP11.1基因和KAP24.1基因为参照基因设计引物;（1）以18S r RNA为管家基因,通过
【基金项目】
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国家自然科学基金项目“角蛋白IFs、KAPs基因对和田羊次级毛囊密度的影响及雄激素对其调剂作用”的部分研究成果（项目编号:31560685）课题主持人:李树伟教授（塔里木大学）；
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【目的】试验旨在对和田羊和卡拉库尔羊KAP11.1和KAP24.1基因进行克隆及表达,探索不同雄激素浓度对蛋白表达量的影响,并对两个基因在绵羊皮肤毛囊中表达量进行比较,为后续深入研究KAP基因功能以及对羊毛品质的影响提供理论基础。【方法】试验以三种绵羊体侧皮肤毛囊为研究材料,以Gen Bank中绵羊KAP11.1基因和KAP24.1基因为参照基因设计引物;（1）以18S r RNA为管家基因,通过q PCR技术检测KAP11.1基因和KAP24.1基因在不同绵羊皮肤毛囊中的表达情况;（2）对KAP11.1基因和KAP24.1基因进行PCR扩增,构建p MD19-T-KAP11.1和p MD19-T-KAP24.1克隆质粒并鉴定,将酶切后的基因片段与p ET-28a载体结合形成原核表达载体并再次进行鉴定,将载体导入BL21大肠杆菌中通过SDS-PAGE得到目的片段,Western Blot技术验证蛋白,分析得到的KAP11.1基因和KAP24.1基因序列;（3）以去掉终止密码子的序列设计引物,PCR扩增KAP11.1基因和KAP24.1基因,连接p MD19-T载体并鉴定,目的片段回收后与p EGFP-N1载体再次连接,构建KAP11.1基因和KAP24.1基因真核表达载体并转染Hela细胞,作SDS-PAGE和Western Blot检测,并对转染后的细胞施以不同浓度雄激素,探究蛋白表达量变化。【结果】（1）KAP11.1基因在山区型和田羊（HS）和卡拉库尔羊（KL）两种绵羊皮肤毛囊中的表达量极显著高于平原型和田羊（HP）（P＜0.01）,山区型和田羊（HS）和卡拉库尔羊（KL）之间没有差异显著性（P＞0.05）。KAP24.1基因在山区型和田羊（HS）中的表达量与平原型和田羊（HP）有极显著差异（P＜0.01）,与卡拉库尔羊（KL）差异显著（P＜0.05）,卡拉库尔羊（KL）表达量显著高于平原型和田羊（HP）（P＜0.05）。（2）三种绵羊KAP11.1基因CDS区序列为480 bp,编码氨基酸数159,KAP24.1基因CDS区序列为759 bp,编码氨基酸数252,KAP11.1和KAP24.1均为不稳定蛋白,且无规则卷曲是构成KAP11.1和KAP24.1蛋白二级结构的主要成分,得到分子质量为19 KDa的KAP11.1和分子质量为30 KDa的KAP24.1原核表达蛋白。（3）得到分子质量为47 KDa的KAP11.1和分子质量为58 KDa的KAP24.1真核表达蛋白,雄激素浓度为10-8mol/L时,KAP11.1三种绵羊表达量均与对照存在显著性差异（P＜0.01）,KAP24.1山区型和平原型和田羊与对照差异显著（P＜0.01）,卡拉库尔羊与对照差异极显著（P＜0.001）。【结论】（1）KAP11.1基因和KAP24.1基因在山区型和田羊中表达量最高,其次是卡拉库尔羊,平原型和田羊最低。（2）成功获得了KAP11.1和KAP24.1原核表达蛋白,均为不稳定蛋白。（3）成功获得了KAP11.1和KAP24.1真核表达蛋白,且雄激素浓度为10-8mol/L可增加KAP11.1和KAP24.1基因表达量,浓度过高或者过低,蛋白表达量都有所下降。
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